4 ERGEBNISSE
4.1 Einfluss der Phosphorylierung von DHBc auf Replikation und Infektiosität von Virionen
4.2.2 Radioaktive Markierung von DHBc
Der Überstand der Präzipitation mit anti-DHBc dagegen war frei von immunreaktivem DHBc. Die Präzipitate von D2-Zelllysat mit NS und die von LMH-Zelllysat mit anti- DHBc oder NS enthielten kein DHBc, während das Präzipitat von D2-Zelllysat mit anti-DHBc beide anti-DHBc-Banden p32 und p34 enthielt. Der anti-anti-DHBc-Antikörper war damit in der Lage, sowohl dephosphoryliertes als auch phosphoryliertes DHBc zu präzipitieren. Die Bindung war fest genug, dass im stringenten ersten Waschschritt kein DHBc nachzuweisen war.
In diesem Experiment wurde leider ebenfalls beobachtet, dass neben DHBc auch viele andere Proteine präzipitiert wurden; so wurde zum Beispiel ein geringer Anteil an DHBL im Immunblot der IP sowohl mit anti-DHBc als auch mit NS nachgewiesen. Zusätzlich erschienen eine Reihe nicht identifizierter Hintergrundbanden von zellulären Proteinen auch bei den IPs von LMH-Zelllysaten, die auch in der Amidoschwarzfärbung sichtbar waren. Auch sollte an dieser Stelle vorausschauend auf die folgenden Daten bemerkt werden, dass die DHBc-Bande, die in der Amidoschwarzfärbung des IP-Pellets mit anti-DHBc sichtbar ist, aller Wahrscheinlichkeit nach nicht von dem Kapsidprotein, sondern von an der Membran gebundenen Antikörpern herrührt. DHBc kommt intrazellulär nicht in Mengen vor, die sich als gefärbte Proteinbanden vor dem Hintergrund eines Gesamtzelllysats hervorheben. Auch war diese Bande im nach dem Blotten gefärbten PAA-Gel nicht zu sehen (nicht gezeigt).
Wegen der recht hohen Menge an unspezifisch kopräzipitierten Proteinen wurden auch verschiedene monoklonale anti-DHBc-Antikörper in transfizierten HuH7-Zellen getestet.
Keiner der getesteten Antikörper führte jedoch zu einer deutlich verringerten Menge an unspezifischem Hintergrund (nicht gezeigt), weshalb für das weitere Experiment wie bisher das polyklonale anti-DHBc-Serum Verwendung fand. Auch Präzipitationen mit Protein-A/G-Agarose statt PanZ führten leider nicht zu einem besseren Ergebnis (nicht gezeigt).
Im nächsten Schritt wurden HuH7-Zellen in 10 cm-Schalen und 6-Loch-Platten ausgesät und jeweils parallel aus demselben Ansatz heraus entweder mit pDHBV16 und pBJ5 oder mit pDHBV16 und pBJ5-CNmut + pBJ5-CNB oder nicht transfiziert (Abbildung 55).
Während die Zellen von den 6-Loch-Platten als Kontrolle dafür Verwendung fanden, dass DHBc bei koexprimiertem CNmut dephosphoryliert wurde, wurden die Zellen der 10 cm-Schalen 24 h nach der Transfektion über Nacht in Serum- und phosphatfreiem Medium mit radioaktivem Phosphat (32P) markiert. Anschließend wurden sie für die IP lysiert, die Zellkerne abzentrifugiert und die Zytoplasmafraktion mit anti-DHBc-vorinkubiertem PanZ
inkubiert. Die Präzipitate wurden mehrfach gewaschen, in Laemmli-Puffer gekocht und parallel mit Aliquots der Ausgangslysate und IP-Überständen auf ein PAA-Gel aufgetragen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie-Blau gefärbt und auf einer Phosphoimager-Platte exponiert (Abbildung 56).
DHBV16 pBJ5 pBJ5-CNmut + pBJ5-CNB +
+
-+ -+
-HuH7-Zellen
DHBc
HA-CNmut
Sumo-GFP
DHBV16 + pBJ5
DHBV16 + CNmut + CNB 1,5 cm-Platte
10 cm-Platte
3 mCi32P ÜN
3 mCi32P ÜN
3 mCi32P ÜN gleicher
Transfektions-ansatz
anti-HA anti-DHBc
anti-GFP
anti-DHBpreS
gleicher Transfektions-ansatz
gleicher Transfektions-ansatz Antikörper
Amidoschwarz-färbung
DHBL – p36
Abbildung 55: Experimentelles Design der radioaktiven Markierung und Immunblot der Lysate HuH7-Zellen wurden zu gleicher Dichte in 10 cm-Schalen und 6-Lochplatten ausgesät und aus denselben Transfektionsansätzen heraus parallel entweder mit pDHBV16 und pBJ5, pDHBV16 und pBJ5-CNmut + pBJ5-CNB oder nicht transfiziert. 24 h später wurde den 10 cm-Schalen radioaktives Phosphat (32P) zugegeben. Nach einer Über-Nacht-Inkubation wurden die Zellen der 6-Loch-Platten und der 10 cm-Schalen geerntet. Die Zellen der 6-Loch-Platten wurden in Laemmli-Puffer lysiert und nach PAGE im Immunblot auf die Expression von DHBc geprüft. Die Zelllysate der 10 cm-Schalen wurden für die IP verwendet.
Wie in Abbildung 55 ersichtlich, kam es durch CNmut-Koexpression wieder zu einem Verlust der p34-Bande von DHBc. Die Transfektionseffizienz war vergleichbar und DHBL konnte in beiden Fällen mit seiner Phosphovariante detektiert werden. Der mit Amidoschwarz gefärbte Blot zeigt, dass die Proteinmenge in äquivalenten Lysat-Volumina ohne Transfektion deutlich höher lag als bei den transfizierten Zellen. Dies ist auch bei dem Auftrag der Lysate und IP-Überstände im Coomassie-gefärbten Gel zu erkennen (Abbildung 56).
Das Coomassie-gefärbte Gel wurde getrocknet und eine Phosphoimager-Platte aufgelegt, um die radioaktiven Signale zu dokumentieren. Im Autoradiogramm (Abbildung 56) ist sehr viel Hintergrund zu erkennen, wie es die Ergebnisse der Immunpräzipitation bereits vermuten ließen. Auf der Höhe von 32 kDa findet sich im IP-Pellet transfizierter Zellen eine Bande, die zwar nicht im IP-Pellet jedoch in dem Lysat und IP-Überstand
nicht-transfizierter Zellen zu finden ist. Es kann daher nicht davon ausgegangen werden, dass es sich bei dieser Bande um eine DHBc-spezifische Bande handelt. Genauso verhält es sich für die Bande, die auf der Höhe von 34 kDa zu finden ist. Diese ist sogar im IP-Pellet nicht transfizierter Zellen zu sehen.
Insgesamt erreichte diese Methode nicht die nötige Sensitivität, um phosphoryliertes DHBc zu zeigen. Ein Grund dafür liegt sicher in der geringen Menge an Kapsidprotein in den Zellen. Ein anderer wichtiger Grund ist die relativ unsaubere Immunpräzipitation, weshalb auch eine Erhöhung der Ausgangsmenge an Protein bzw. transfizierten Zellen wahrscheinlich keine wesentlich bessere Empfindlichkeit liefern würde.
50
40
30 25 20 pDHBV16 pBJ5 pBJ5-CNmut + pBJ5-CNB
-+ +
-+ -+
-+ +
-+ -+
-+ +
-+ -+
pDHBV16 pBJ5 pBJ5-CNmut + pBJ5-CNB
Coomassie-Blau-Färbung Autoradiogramm
-+ +
-+ -+
-+ +
-+ -+
-+ +
-+ -+
Lysat Ü IP
Lysat Ü IP
kDa
Abbildung 56: Autoradiogramm und Coomassie-gefärbtes Gel der radioaktiven Markierung
HuH7-Zellen wurden in 10 cm-Schalen und entweder mit pDHBV16 und pBJ5, pDHBV16 und pBJ5-CNmut + pBJ5-CNB oder nicht transfiziert. 24 h später wurde den 10 cm-Schalen 32P zugegeben. Nach einer Über-Nacht-Inkubation wurden die Zellen lysiert und die zytoplasmatischen Fraktionen einer Immunpräzipitation (IP) unterzogen. Aliquots der Lysate, der IP-Überstände (Ü) und der IP-Pellets wurden durch PAGE aufgetrennt. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau gefärbt, getrocknet (links) und auf einer Phosphoimager-Platte exponiert (rechts).