4 ERGEBNISSE
4.1 Einfluss der Phosphorylierung von DHBc auf Replikation und Infektiosität von Virionen
4.1.2 Dephosphorylierung von DHBc durch Calcineurin und PP2A
4.1.2.5 Die Expression von Calcineurin und PP2A in der Entenleber
Nachdem gezeigt worden war, dass die Kulturen primärer Entenleberzellen Calcineurin und PP2A exprimierten, war es von Interesse herauszufinden, welche Zelltypen für diese Expression verantwortlich sind. Die fötale Entenleber besteht nur zu etwa 60% aus Parenchymzellen. Ein nicht unerheblicher Teil der übrigen Zellen sind LSECs.
Makrophagen, Gallengangs- und Itozellen fanden sich genau so in der Kultur wie ein Rest an Blutzellen. Zwar erlaubte die angewandte Präparationsmethode eine leichte Anreicherung von Hepatozyten und das verwendete Medium einen gewissen selektiven Vorteil für deren Wachstum, doch bestand bereits makroskopisch sichtbar eine deutliche Inhomogenität der PDLC-Kulturen ab dem dritten Tag nach der Aussaat. Aus diesem Grunde schien es unumgänglich, die PDLC-Kulturen, die bei der verwendeten Präparationsmethode erhalten wurden, in Bezug auf ihre zelluläre Zusammensetzung näher zu charakterisieren. Zum Vergleich wurden Kryodünnschnitte fötaler Entenlebern (Abbildung 28a) herangezogen, um Unterschiede in der Distribution der verschiedenen Zelltypen aufzudecken.
Von acetyliertem LDL (acLDL) ist bekannt, dass es ausschließlich von LSECs und mit etwas geringerer Affinität von Makrophagen aufgenommen wird (Irving et al., 1984; Okaji et al., 2004). Auf der Suche nach einem Antikörper, der LSECs markiert, um diese auch in Leberschnitten darstellen zu können, wurde ein anti-NFATc1-Antikörper identifiziert, dessen Färbemuster mit dem von acLDL identisch war (Abbildung 28b). Die Markierung
von Entenleberdünnschnitten mit anti-NFATc1 ergab das für LSECs typische Muster (Abbildung 28c). Somit konnte der anti-NFATc1 Antikörper für die spezifische Markierung von LSECs unter Berücksichtigung eventuell ebenfalls reagierender Makrophagen Verwendung finden. Die gleichzeitige Darstellung von Kupfferzellen mit Antikörpern gelang leider nicht. Ihre Anwesenheit in PDLC-Kulturen konnte aber mittels Tuschefärbung bestätigt werden (nicht gezeigt).
Interessanterweise zeigten LSECs in der PDLC-Kultur ein vollkommen anderes Wachstumsmuster als in der Leber. Sie bildeten einen „Monolayer“ zusammenhängender Zellen, die von Hepatozyten überwachsen werden konnten. Es entstand so nach einigen Tagen der Kultivierung eine mehrschichtige Zellkultur (nicht gezeigt), während LSECs in der Leber die Sinusoide auskleiden und eine Art Netz bilden (Abbildung 28c).
a
b
NFATc1
NFATc1 NFATc1
NFATc1 acLDL
Hoechst acLDL+ +Hoechst
c
Durchlicht +Hoechst
+Hoechst NFATc1
NFATc1
Abbildung 28: Darstellung der LSECs in fetaler Entenleber
[a] HE-Färbung eines Gefrierdünnschnitts fötaler Entenleber zur Kontrolle der Qualität der Schnitte, [b] anti-NFATc1-Antikörper (rot) reagierten in der PDLC-Kultur nur mit Zellen, die acLDL aufnahmen (grün), [c]
Kryodünnschnitte von Entenleber wurden mit anti-NFATc1 (rot) markiert. Die Darstellung der Zellkerne erfolgte mit dem Hoechstfarbstoff.
Gallengangszellen von der Ente können mit einem speziellen anti-Zytokeratin-Antikörper (CAM5.2) identifiziert werden (Lee et al., 2001). In Entenleberkryoschnitten werden mit diesem Antikörper einerseits angeschnittenene Gallengänge sichtbar, andererseits einzelne Zellen der Gallekanälchen, die das Parenchym durchziehen (Abbildung 29). Ein völlig anderes Bild sieht man in PDLC-Kulturen. Hier werden größere Gruppen von Zellen
innerhalb der Parenchymzellbereiche angefärbt. Ob es sich bei diesen um die ursprünglichen Gallengangszellen handelte oder um unter den Kulturbedingungen zu Gallengangszellen ausdifferenzierende Hepatozyten konnte nicht eruiert werden.
Entenleberschnitt PDLC-Kultur
CAM5.2 CAM5.2
CAM5.2 CAM5.2
+Hoechst +Hoechst
+Hoechst +Hoechst
1:20
1:40
Abbildung 29: Darstellung von Gallengangszellen in Entenleber und PDLC-Kulturen
Kryodünnschnitte fetaler Entenleber und PDLC-Kulturen wurden fixiert und Gallengangszellen mit dem anti-Zytokeratin-Antikörper CAM5.2 (rot) markiert. Die Darstellung der Zellkerne erfolgte mit dem Hoechstfarbstoff.
Parenchymzellen konnten identifiziert werden, indem die PDLC-Kultur mit DHBV infiziert wurde und der Nachweis der viralen Proteine erfolgte. Es wurde allerdings berichtet, dass Hepadnaviren neben Hepatozyten sehr viel schwächer auch Gallengangszellen infizieren können (Lee et al., 2001). Darum wurde immunzytochemisch geprüft, ob die Cam5.2-positiven Zellen der verwendeten PDLC-Kulturen mit DHBV infiziert werden können. Abbildung 30 zeigt, dass in keiner der Zellen, die durch Cam5.2 markiert wurden, DHBVL und somit eine Infektion nachweisbar war. Daher konnte davon ausgegangen werden, dass es sich bei den mit anti-DHBpreS markierten Zellen mit großer Sicherheit um DHBV-infizierte Hepatozyten handelte.
Für die Identifizierung Calcineurin- und PP2A-exprimierender Zellen wurden zunächst Kryodünnschnitte von fötaler Entenleber untersucht, da sich hier der Zelltyp anhand seines Färbemusters leichter bestimmen ließ. Es zeigte sich, dass Calcineurin B im Parenchym exprimiert wurde (Abbildung 31a). Die Markierungen mit anti-Calcineurin-PAN A und anti-PP2A dagegen ergaben eine Überlagerung mit NFATc1-positiven Zellen (Abbildung
31b und c). Demzufolge sind Calcineurin A und PP2A wahrscheinlich vorwiegend in LSECs der fötalen Entenleber exprimiert.
DHBL +Cam5.2 +Hoechst DHBL +Cam5.2 +Hoechst
1:20 1:100
Abbildung 30: Gallengangszellen werden in vitro nicht mit DHBV infiziert
Eine PDLC-Kultur wurde in vitro mit DHBV-positivem Entenserum infiziert. Nach 7 Tagen wurden die Zellen fixiert und infizierte Zellen mit dem anti-DHBpreS-Antikörper gegen DHBL (rot) dargestellt.
Gleichzeitig erfolgte die Markierung von Gallengangszellen mit dem Antikörper anti-Cam5.2 (grün).
CNB
NFATc1 PP2A
PAN-CNA NFATc1+PAN-CNA Hoechst +PAN-CNA NFATc1 +
NFATc1
a
b
c
Ziege Kaninchen
d
NFATc1+
Ziege+
Hoechst + NFATc1 +
Hoechst + Ziege + +Hoechst Durchlicht
PP2A
Kaninchen
PP2A
Kaninchen CNB
Abbildung 31: Expression von Calcineurin A, Calcineurin B und PP2A in Entenleber
Kryodünnschnitte von Entenleber wurden fixiert und mit verschiedenen Erstantikörpern behandelt, die anschließend durch fluoreszenzmarkierte Zweitantikörper sichtbar gemacht wurden. [a] anti-CNB (rot), [b]
anti-CN-PAN A (rot) und anti-NFATc1 (grün), [c] anti-PP2A (rot) und anti-NFATc1 (grün), [d] Kontrolle nur mit Zweitantikörpern.
Als nächstes wurde das Expressionsmuster der Phosphatasen in in vitro-PDLC-Kulturen untersucht (Abbildung 32 und Abbildung 33). Anhand infizierter Hepatozyten in einer PDLC-Kultur konnte die Expression von Calcineurin B den Parenchymzellen zugeordnet werden (Abbildung 32). Die Koimmunfluoreszenz von NFATc1 mit CNA und PP2A weist auch in PDLC-Kulturen die Expression der katalytischen Untereinheiten beider Phosphatasen hauptsächlich den LSECs zu (Abbildung 33).
CNB
CNB
Hoechst+CNB +DHBL DHBL
DHBL Hoechst+ CNB +DHBL
Abbildung 32: Calcineurin B-Expression in Hepatozyten in PDLC-Kulturen
DHBV-infizierte PDLC-Kulturen wurden fixiert und mit Antikörpern gegen DHBL (rot) und CNB (grün) behandelt, welche anschließend durch fluoreszenzmarkierte Zweitantikörper sichtbar gemacht wurden. Beide Proteine lokalisierten in denselben Zellen.
a
b
PP2A NFATc1
PAN-CN
NFATc1 NFATc1+ +Hoechst
NFATc1+ +Hoechst PAN-CN
PAN-CN
Abbildung 33: Calcineurin A- und PP2A-Expression in LSECs in PDLC-Kulturen
PDLC-Kulturen wurden fixiert und mit Antikörpern gegen NFATc1 (grün) und [a] PAN-CNA (rot) bzw. [b]
PP2A (rot) behandelt, die anschließend durch fluoreszenzmarkierte Zweitantikörper sichtbar gemacht wurden. Sowohl CNA als auch PP2A lokalisierten in denselben Zellen wie NFATc1.
Diese Ergebnisse schließen nicht aus, dass Calcineurin und PP2A auch in den Hepatozyten der Ente exprimiert werden. Dafür spricht, dass PP2A ein ubiquitäres Enzym ist, welches in allen bisher untersuchten Zellen exprimiert wird; und andererseits eine
Calcineurinaktivität in der Leber, speziell auch in Hepatozyten der Ratte, messbar ist (Webster et al., 2002). Wahrscheinlicher ist, dass die Expression der Phosphatasen im Vergleich zu LSECs viel niedriger ist und aus diesem Grund in der Immunfluoreszenzfärbung nicht nachgewiesen werden konnte. Es ist aber auch denkbar, dass die Enzyme der Ente keine Kreuzreaktion mit den verwendeten Antikörpern zeigten und LSECs unspezifisch markiert wurden. Letzteres erscheint jedoch aufgrund der Tatsache, dass im Immunblot von PDLC-Lysaten eine Bande auf derselben Höhe, wie sie für Calcineurin zu erwarten ist, nachgewiesen werden konnte, unwahrscheinlich.
4.1.3 Der Einfluss von Calcineurin- und PP2A-Inhibitoren auf die