4 ERGEBNISSE
4.1 Einfluss der Phosphorylierung von DHBc auf Replikation und Infektiosität von Virionen
4.1.3 Der Einfluss von Calcineurin- und PP2A-Inhibitoren auf die DHBc-Phosphorylierung in LMH-
4.1.3.1 Einfluss von CsA als Inhibitor und PMA/Ionomycin als Stimulatoren von Calcineurin
(Webster et al., 2002). Wahrscheinlicher ist, dass die Expression der Phosphatasen im Vergleich zu LSECs viel niedriger ist und aus diesem Grund in der Immunfluoreszenzfärbung nicht nachgewiesen werden konnte. Es ist aber auch denkbar, dass die Enzyme der Ente keine Kreuzreaktion mit den verwendeten Antikörpern zeigten und LSECs unspezifisch markiert wurden. Letzteres erscheint jedoch aufgrund der Tatsache, dass im Immunblot von PDLC-Lysaten eine Bande auf derselben Höhe, wie sie für Calcineurin zu erwarten ist, nachgewiesen werden konnte, unwahrscheinlich.
4.1.3 Der Einfluss von Calcineurin- und PP2A-Inhibitoren auf die
behandelten Zellen. Eine Hyperphosphorylierung von DHBc, soweit dies anhand der noch vorhandenen p34 und p32-Banden beurteilt werden kann, trat nicht auf.
pDHBV16 CsA [µM]
+
-+ 1
+ 2
+ 3
+ 4
+ 5
-DHBc
DHBc längere Exp.
+ 1
+ 2
+ 3
+ 4
+ 5 +
-anti-β-Aktin
Sumo-GFP HuH7-Zellen
β-Aktin anti-GFP
anti-DHBpreS anti-DHBc
anti-DHBc
pDHBV16 CsA [µM]
Antikörper
Amidoschwarz-färbung
DHBL – p36 DHBL – p28
Abbildung 34: Einfluss von CsA auf transfiziertes DHBc in HuH7-Zellen
HuH7-Zellen wurden mit dem DHBV-Expressionsplasmid pDHBV16 und einem Kontrollexpressionsplasmid für Sumo-GFP transfiziert und beginnend nach der Transfektion mit der angegebenen Konzentration CsA für 5 Tage bei täglichem Mediumwechsel behandelt oder nicht behandelt.
Die Zellen wurden anschließend lysiert und im Immunblot auf die Expression der angegebenen Transgene geprüft. Zur Kontrolle, ob vergleichbare Mengen an proteinhaltigen Lysaten aufgetragen wurden, wurde der Blot mit Amidoschwarz gefärbt.
Abbildung 35 zeigt ein ähnliches Ergebnis für pDHBV-3t-transfizierte LMH-Zellen. Hier wurde die Transgenexpression bereits bei einer CsA-Konzentration von 1 µM so schwach, dass DHBc nicht mehr nachweisbar war. Auch die Expression des Kontrollproteins Sumo-GFP war sehr deutlich reduziert. DHBL dagegen wurde nur geringfügig schwächer exprimiert. Aufgrund der nicht nachweisbaren DHBc-Expression konnte für dieses Experiment keine Aussage über den Phosphorylierungsstatus von DHBc nach CsA-Behandlung gemacht werden.
Insgesamt konnte durch CsA-Behandlung die Phosphataseaktivität von endogenem Calcineurin in HuH7-Zellen nicht derart inhibiert werden, dass es zu der erwarteten Hyperphosphorylierung von DHBc kam. Dies könnte bedeuten, dass die Hypophosphorylierung von DHBc durch CNmut unspezifisch erfolgte oder Calcineurin an einem Signalweg beteiligt ist, der durch seine Inhibition nicht gehemmt wird und auch bei Calcineurininhibition zur DHBc-Dephosphorylierung führt. Eine weitere Möglichkeit
wäre, dass hyperphosphoryliertes DHBc sofort durch Proteasomen abgebaut wird und deswegen nicht nachzuweisen ist. Sowohl in HuH7- als auch in LMH-Zellen dagegen wirkte sich die CsA-Behandlung aus unbekannten Gründen auf die Expression der Transgene negativ aus.
pDHBV-3t 1 µM CsA
-+
-+ +
DHBc
Sumo-GFP anti-GFP
anti-DHBpreS anti-DHBc
LMH Antikörper
Amidoschwarz-färbung
DHBL – p36 DHBL – p28
Abbildung 35: Einfluss von CsA auf transfiziertes DHBc in LMH-Zellen
LMH-Zellen wurden mit dem DHBV-Expressionsplasmid DHBV-3t und einem Kontrollexpressionsplasmid für Sumo-GFP transfiziert und beginnend nach der Transfektion mit 1 µM CsA für fünf Tage bei täglichem Mediumwechsel behandelt oder nicht behandelt. Die Zellen wurden anschließend lysiert und im Immunblot auf die Expression der angegebenen Transgene geprüft. Zur Kontrolle, ob vergleichbare Mengen an proteinhaltigen Lysaten aufgetragen wurden, wurde der Blot mit Amidoschwarz gefärbt.
Nun wurde als entgegengesetzter Ansatz zur Überexpression der Phosphatase versucht, endogenes Calcineurin durch Behandlung mit Ionomycin und PMA zu stimulieren. Zur Kontrolle der Calcineurinaktivität diente ein Expressionsplasmid für ein Fusionsprotein aus GFP und humanem NFATc. Dieses ist ohne Verwendung eines markierten Antikörpers im Fluoreszenz-mikroskop sichtbar. Wie Abbildung 36a zeigt, lokalisiert GFP-NFAT bei koexprimiertem konstitutiv aktivem Calcineurin in einem punktförmigen Muster im Zellkern. Ein ähnliches Bild wäre demnach auch zu erwarten, wenn die Aktivität des endogenen Calcineurins deutlich gesteigert würde.
Der Einfluss der PMA/Ionomycin-Stimulation auf die Lokalisation von exogen in HuH7-Zellen exprimiertem GFP-NFAT ist in Abbildung 36b gezeigt. Der Einsatz von Ionomycin allein oder in Kombination mit PMA führte nicht zu der erwarteten Translokation von GFP-NFAT in den Zellkern. Teilweise wurde neben der diffusen zytoplasmatischen Verteilung auch eine zellmembranständige Lokalisation beobachtet, jedoch niemals ein punktuelles Muster oder eine diffuse Verteilung von GFP-NFAT im Zellkern.
Gründe für das Scheitern der Calcineurin-Stimulation könnten darin liegen, dass die Menge an endogenem Calcineurin zu gering war, um die Masse an überexprimiertem
GFP-NFAT zu dephosphorylieren. Möglich ist auch, dass sich Calcineurin in Hepatomzellen durch die üblichen Reagenzien nicht so gut wie jenes in z.B. B-Zellen stimulieren lässt (Lara-Pezzi et al., 1998).
unbehandelt Ion PMA + Ion
GFP-NFAT +Hoechst
GFP-NFAT +Hoechst
GFP-NFAT +Hoechst GFP-NFAT +Hoechst
GFP-NFAT +Hoechst GFP-NFAT +Hoechst
pGFP-NFAT + pBJ5
pGFP-NFAT + pBJ5-CNmut + pBJ5-CNB
Transfektion mit:
GFP-NFAT +Hoechst
GFP-NFAT +Hoechst
a b
Abbildung 36: Rekombinantes GFP-NFAT wird nach Stimulation endogenen Calcineurins nicht in den Zellkern transloziert
[a] HuH7-Zellen wurden mit pGFP-NFAT transfiziert und dessen Lokalisation nach Stimulation von endogenem Calcineurin durch 40 ng/ml PMA und 1 mM Ionomycin (Ion) durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Vergrößerung 1:100, [b] HuH7-Zellen wurden mit pGFP-NFAT und pBJ5 (oben) oder pBJ5-CNmut und pBJ5-CNB (unten) kotransfiziert und die Lokalisation von GFP-NFAT nach Markierung der Zellkerne durch Hoechst untersucht. Vergrößerung 1:40
Um die erste Erklärungsvariante zu prüfen, wurde weiterhin im Immunblot untersucht, ob überexprimiertes, rekombinantes Calcineurin A durch Anwendung von PMA und Ionomycin stimuliert werden kann (Abbildung 37). Dafür wurden HuH7-Zellen mit pNFATc2 und pBJ5-CNmut + pBJ5-CNB oder pBJ5-CNA + pBJ5-CNB transfiziert und mit verschiedenen Konzentrationen an Ionomycin und PMA stimuliert. CNmut konnte NFATc2 wie oben gezeigt fast vollständig dephosphorylieren; durch unstimuliertes CNA dagegen fand keine sichtbare NFATc2-Dephosphorylierung statt. Die Anwendung der Stimulatoren von Calcineurin führte trotz Einsatz sehr hoher Konzentrationen nicht zur vollen Aktivität von Calcineurin. Jedenfalls wurde nur ein geringer Teil des NFATc2 dephosphoryliert.
Ein ähnliches Experiment wie in Abbildung 37 ist in Abbildung 38 zu sehen. Hier wurden HuH7-Zellen mit pNFATc1 und den verschiedenen Expressionsvektoren für Calcineurin kotransfiziert. Um die Aktivität von Calcineurin zu unterdrücken, wurden die Zellen mit CsA behandelt; um Calcineurin zu aktivieren, wurden Ionomycin und PMA eingesetzt.
CNmut führte zur fast vollständigen Dephosphorylierung von NFATc1. Seine Aktivität wurde durch CsA nicht blockiert. Dies war auch zu erwarten, da die Funktion von CsA auf der gemeinsamen Bindung mit Calmodulin an Calcineurin beruht und der konstitutiv aktiven Mutante von Calcineurin die Calmodulin-bindende Domäne fehlt.
Stimulation A Stimulation B Stimulation C
-+
-+
-+
Stimulation A = 20 ng / ml PMA + 500 nM Ionomycin Stimulation B = 40 ng / ml PMA + 1 mM Ionomycin Stimulation C = 100 ng / ml PMA + 2 mM Ionomycin
HA-P-NFATc2 HA-P-NFATc2 HA-NFATc2 HA-NFATc2
Anti-körper
anti-HA
NFATc2
CNA + CNB CNmut
+ CNB
Abbildung 37: ektopisch exprimiertes CNA ist durch Stimulatoren nicht vollständig aktivierbar HuH7-Zellen wurden mit den Expressionsvektoren pNFATc2 und CNA bzw. CNmut und pBJ5-CNB kotransfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen über Nacht mit verschiedenen Konzentrationen an PMA und Ionomycin behandelt, anschließend lysiert und im Immunblot auf den Phosphorylierungsstatus von NFATc2 hin untersucht.
CsA [1 µM]
Ion + PMA
-+
-+
-+
+ +
HA-CNA HA-CNA
HA-CNmut HA-CNmut HA-P-NFATc1 HA-P-NFATc1 HA-NFATc1 HA-NFATc1 anti-HA
anti-HA anti-HA Anti-körper
CNmut +CNB
CNA pBJ5 +CNB
NFATc1
Abbildung 38: CsA unterdrückt die PMA/Ionomycin-Stimulation von CNmut nicht und von CNA nur geringfügig
HuH7-Zellen wurden mit den Expressionsvektoren pNFATc1 und CNA bzw. CNmut und pBJ5-CNB kotransfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen über Nacht mit 40 ng/ml PMA und 1 mM Ionomycin behandelt, anschließend lysiert und im Immunblot auf die Expression von NFATc1, CNA und CNmut untersucht.
Wurden die mit Expressionsvektoren für CNA und CNB transfizierten Zellen mit Ionomycin und PMA behandelt, wurde NFATc1 nur teilweise dephosphoryliert. Die gleichzeitige Anwendung von CsA führte zu einer nur geringfügigen Verhinderung der Dephosphorylierung. Dieses Ergebnis ist zusammen mit den in Abbildung 34 und 4.1.1.2
gezeigten Resultaten ein Hinweis, dass Calcineurin in Leberzellen bzw. Hepatomzellen möglicherweise nicht effektiv durch CsA gehemmt werden kann.
Schließlich wurde versucht, durch Stimulation von durch Transfektion exprimiertem CNA in HuH7- und LMH-Zellen mit Ionomycin und PMA die Dephosphorylierung von DHBc zu verstärken (Abbildung 39). Dabei wurde deutlich, dass überexprimiertes CNA zu einer leichten Dephosphorylierung von DHBc nur in HuH7-Zellen und nicht in LMH-Zellen führte. Zugleich gelang es nicht, das rekombinante Calcineurin mit Ionomycin/PMA-Behandlung zu einer deutlich verstärkten Dephosphorylierung von DHBc anzuregen.
Insgesamt kann daher festgehalten werden, dass weder der Calcineurin-Inhibitor CsA noch die Calcineurin-Stimulatoren Ionomycin/PMA eine effektive Regulation von Calcineurin in HuH7- und LMH-Zellen erlaubten.
prk5-DHBc pBJ5-CNA Stimulation
+ -+
+
-+ + +
+ +
-DHBc p34 DHBc p34 DHBc p32 DHBc p32 HuH7-Zellen
DHBVwt3-t pBJ5-CNA Stimulation
+ -+
+
-+ + +
+ + -LMH-Zellen
DHBc p34 DHBc p34 DHBc p32 DHBc p32
Abbildung 39: Calcineurin-Stimulation hat nur einen geringen Einfluss auf die Dephosphorylierung von DHBc in HuH7-Zellen, gar keinen nachweisbaren in LMH-Zellen
HuH7- und LMH-Zellen wurden mit Plasmiden, die zur Expression von DHBc führen, transfiziert. Zum Teil wurde ein Expressionsvektor für CNA kotransfiziert. Die Zellen wurden 2 Tage nach der Transfektion mit 500 mM Ionomycin und 40 ng/ml PMA über Nacht stimuliert, anschließend lysiert und die Lysate im Immunblot auf Expression von DHBc hin untersucht.