Immunblot

Beim Immunblot werden die in der SDS-PAGE aufgetrennten Proteingemische aus der Polyacrylamidmatrix über ein senkrecht zum Gel angelegtes elektrisches Feld auf eine Membran aus Nitrozellulose, Nylon oder PVDF transferiert. Dabei bleibt das Muster der elektrophoretischen Auftrennung erhalten. Bei diesem Vorgang wird das an den Proteinen angelagerte SDS ausgewaschen. Daher können die Proteine renaturieren und teilweise ihre Sekundär- und Tertiärstruktur wieder einnehmen, nicht aber ihre Quartärstruktur. Die Proteine können dadurch von Antikörpern erkannt werden. Die Bindung der Proteine an die Membran erfolgt durch hydrophobe Wechselwirkungen. Für den Transfer wurde das Semidry-Blot-System gewählt, es hat den Vorteil, dass der Transfer gleichmäßig über das ganze Gel erfolgt und nur geringe Mengen an Puffer benötigt werden.

Nach dem Transfer der Proteine auf die Membran müssen zuerst die noch freien Bindungsstellen der Membran blockiert werden, da sich sonst die Antikörper auch an diese

Bindungsstellen heften und ein spezifischer Nachweis von Antigenen nicht möglich wäre.

Das Blockieren der freien Bindungsstellen erfolgt mit einem für die Antikörper nicht erkennbaren Protein. Dafür eignen sich sowohl BSA (engl.: bovine serum albumin), als auch Milchpulver, Myoglobin oder Hämoglobin.

Um die spezifische Bindung der Antikörper an die Epitope des Antigens nachzuweisen, wird ein Spezies-spezifischer sekundärer Antikörper verwendet, der kovalent mit Enzymen wie z.B. HRPO (engl.: horseradish peroxidase) gekoppelt ist. HRPO kann verschiedene Substrate umsetzen, darunter das Chemilumineszenzsubstrat Luminol, wodurch Licht emittiert wird. Die Lichtemission kann mithilfe von Röntgenfilmen oder einer CCD-Kamera festgehalten werden, wobei für gleiche Signalintensitäten die Expositionszeit für eine Kameraaufnahme ca. 10-mal länger ist als die für einen Röntgenfilm.

Semidry-Transfer-Verfahren nach Schleicher & Schüll

Nach Beendigung des Elektrophoreselaufs wurden die Gele von den Glasplatten gelöst und das Sammelgel mit einem Skalpell abgetrennt und verworfen. Das Trenngel wurde bis zum Gebrauch in Puffer 3 inkubiert. Zwei passend zugeschnittene dicke Whatman-Papiere (GB 004) wurden mit Puffer 1 getränkt und auf die untere Elektrode (Anode) aufgelegt. Es folgte ein in Puffer 2 getränktes Whatman-Papier. Darauf wurde eine in Methanol aktivierte und mit Puffer 2 getränkte PVDF-Membran platziert. PVDF hat eine besonders hohe Proteinbindekapazität und den Vorteil, dass sie so engmaschig ist, dass kleinere Proteine auch nach ausgedehntem Transfer nicht durch sie hindurchwandern können.

Zudem ist sie mechanisch stärker beanspruchbar als Nitrozellulose oder Nylon und daher für den Nachweis mehrerer Antigene nacheinander gut geeignet. Auf die Membran wurde das Gel gelegt und mit drei in Puffer 3 getränkten Whatman-Papieren abgeschlossen. Nach jeder Lage wurde mit einem Glasröhrchen eventuell zwischen den Lagen verfangene Luft weggerollt. Sollten zwei Gele gleichzeitig transferiert werden, wurde über das erste Gel nur ein Whatman-Papier mit Puffer 3 gelegt. Darauf folgte eine Dialyse-Membran, die in Puffer 2 getränkt worden war. Dann wieder ein Whatman-Papier in Puffer 2, die zweite Membran, das Gel und als Abschluss 3 in Puffer 3 getränkte Whatman-Papiere. Der Deckel (Kathode) wurde oben aufgelegt und der Transfer erfolgte zunächst für 10 min mit 12 V, danach weitere 1,5 h bei 20 V.

Immunologischer Nachweis der Antigene

Die Membran aus dem Semidry-Transfer wurde für mindestens 2 h bei 4°C in 5%iger Trockenmilchlösung in ddH2O geblockt. Dann wurde die Membran in einer 3%igen

Milchlösung in TBS mit einer Verdünnung des ersten Antikörpers nach Angaben des Herstellers oder eigenen Maßgaben für mindestens 1 h bei Raumtemperatur oder bei 4°C über Nacht inkubiert. Ungebundener Antikörper wurde mit drei Waschschritten von je 10 min in TBS-T entfernt. Dann wurde die Membran mit einer Verdünnung des zweiten HRPO-markierten Antikörpers (10 ng/ml) in 3%iger Milchlösung in TBS für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Wieder wurde die Membran 3-mal für 10 min mit TBS-T gewaschen. Der Nachweis des gebundenen HRPO-markierten Zweitantikörpers erfolgte mit dem SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate nach den Angaben des Herstellers. Ein der Blotgröße angemessenes Volumen an Lösungen wurde im Verhältnis 1:1 gemischt und für 5 min auf der Membran inkubiert. Überschüssige Flüssigkeit wurde ablaufen gelassen und die Membran auf einer Glasplatte mit Frischhaltefolie eingeschlagen. Zur Dokumentation der Signale wurde ein Röntgenfilm aufgelegt und eine entsprechende Zeit exponiert. Die Entwicklung der Filme erfolgte in einer automatischen Entwicklermaschine der Firma Agfa.

War der Nachweis abgeschlossen, wurden weitere Antikörperbehandlungen durchgeführt, bis alle gewünschten Antigene nachgewiesen waren. Dabei wurden die verschiedenen Erstantikörper in der Reihenfolge ihrer zu erwartenden Signalstärke, beginnend mit dem schwächsten, verwendet. So konnte auf das „Strippen“ der Membran zwischen den einzelnen Behandlungen verzichtet werden. Die Erstantikörperlösungen wurden mit 0,2%

Natriumazid versetzt, um eine längere Lagerfähigkeit zu ermöglichen. War der Immunnachweis abgeschlossen, wurde die Membran für 5 min mit Amidoschwarz gefärbt, in Entfärbelösung gewaschen und getrocknet. Die Proteinbanden und auch die Banden des Molekulargewichtsmarkers konnten so sichtbar gemacht werden.

Lösungen:

Puffer 1: 300 mM Tris/HCl (pH 10,4) Puffer 2: 25 mM Tris/HCl (pH 10,4)

Puffer 3: 40 mM Norleucin / 5 mM Tris (pH 9,4)

Amidoschwarz: 0,1% Amidoschwarz, 45% Methanol, 10% Eisessig Entfärbelösung: 20% Ethanol, 3,5% Eisessig

TBS: 150 mM NaCl, 10 mM Tris/HCl (pH 7,6) TBS-T: 0,1% Tween 20 in TBS

3.2.6.4 2D-Elektrophorese

Die zweidimensionale Elektrophorese ist eine weit verbreitete Methode, komplexe Proteingemische nacheinander nach zwei unabhängigen Parametern aufzutrennen. Dadurch

erhält man eine wesentlich bessere Auflösung, als es die eindimensionale Auftrennung ermöglicht. Die erste Dimension ist eine isoelektrische Fokussierung (IEF) und trennt Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt. Der isoelektrische Punkt ist der pH-Wert, an dem sich die positiven und negativen Ladungen eines Proteins aufheben und die Nettoladung Null beträgt. Dem folgt in der zweiten Dimension eine SDS-PAGE, welche die Proteine anhand ihres Molekulargewichts trennt.

IEF und anschließende PAGE wurden in Kooperation mit Dr. Heukeshofen am Heinrich-Pette-Institut durchgeführt.

Probenvorbereitung:

Die Zellen einer 6-Loch-Platte wurden gewaschen, pelletiert und in 500 µl 2% SDS, 5% ß-Mercaptoethanol lysiert. Mit 50 µl 0,5 M MgCl2 wurde die MgCl2-Konzentration auf 50 mM eingestellt. Dann wurde 1 µl Benzonase zugegeben und das Lysat 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden unlösliche Bestandteile durch Zentrifugation bei 14 000 rpm für 5 min pelletiert. Der Überstand wurde auf eine Konzentration von 15% TCA, 15 % Isopropanol gebracht und 30 min auf Eis gefällt. Das Präzipitat wurde 1 min bei 14 000 rpm pelletiert, einmal mit 15% TCA, 15 % Isopropanol nachgewaschen und mit Ultraschall gut gelöst. Dann wurde es erneut 1 min bei 14 000 rpm pelletiert und 3 x mit Ether gewaschen. Das Pellet wurde kurz trocknen gelassen und in 7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 4% Chaps, 0,5% DTT und 40 mM Tris pH 7,0 aufgenommen und bei RT unter gelegentlichem Mischen mindestens 1 h oder so lange, bis es sich vollständig gelöst hatte, stehen gelassen.

IEF:

Die IEF erfolgte auf IPG-Streifen der Firma Amersham Pharmacia Biotech mit linearem pH-Gradienten von 7 bis 10. Die Proben wurden nach der Rehydrierung der Streifen über einen „Proben-Cup“ am pH 7-Ende der Streifen aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte bei 65 kVh.

PAGE:

Nach der IEF wurden die IPG-Streifen in SDS-Puffer äquilibriert und auf ein 12%iges PAA-Gel montiert.

Nach der Elektrophorese wurden die Gele geblottet und DHBc immunologisch nachgewiesen wie in 3.2.6.3 beschrieben.