3.3 Gelelektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäurefragmenten
3.5.2 Vorbereitung der Sequenzierung am ABI-Sequenzierer
Bevor die Sequenzierung starten konnten, waren mehrere Schritte notwendig. Als erstes musste das PCR-Produkt aufgereinigt werden (1. Aufreinigung), d.h., überschüssige Primer und Nukleotide mussten entfernt werden. Dieses geschah mit Hilfe des GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amershan Biosciences).
Zunächst wurde gegebenenfalls vorhandenes Öl vom PCR-Produkt abpipettiert. Anschließend wurde das PCR-Produkt (50 µl) mit 500 µl „Capture Buffer“ in einem mitgelieferten GFX-Röhrchen gemischt und für 30 sec. bei ca. 13500 rpm zentrifugiert. Die Lösung im Auffanggefäß wurde verworfen und das GFX-Röhrchen mit 500 µl „Wash Buffer“ aufgefüllt.
Dann erfolgte eine zweite Zentrifugation bei 13500 rpm für 30 sec. Das Auffanggefäß mit der Lösung wurde verworfen und durch ein Eppendorf-Reaktionsgefäß ersetzt. Nach Zugabe von 50 µl HPLC-H2O und einer Einwirkzeit von 60 sec. erfolgte ein letztes Mal für 60 sec. eine
Zentrifugation bei 13500 rpm. Das aufgereinigte PCR-Produkt befand sich nun in dem Eppendorf-Reaktionsgefäß (Endvolumen wieder 50 µl), es erfolgte eine Kontrolle in 2%igem Agarosegel.
Der nun folgende Ansatz für die Sequenzierungsreaktion bestand aus:
Für die Einzelansätze: Für die Proben auf den Platten (s.u.):
2,0 µl aufgereinigtem PCR-Produkt 5 µl aufgereinigtem PCR-Produkt 1,6 µl Primer (1 pmol/µl) 2 µl Primer (1 pmol/µl)
1,5 µl Puffer 2 µl Puffer
1,0 µl Big Dye 1 µl Big Dye
3,9 µl HPLC-H2O PCR-Bedingungen:
Schritt Temp. (°C) Zeit (s) Vordenaturierung 96 60
Denaturierung 96 10
Annealing 50 5
Elongation 60 240
Haltezyklus 12 ∞
26 Zyklen
Im Anschluss an die Sequenzierungs-PCR wurde das Produkt einer zweiten Aufreinigung unterzogen, um erneut überschüssige Reste, insbesondere nicht eingebaute fluoreszenz-markierte Terminatoren und Nebenprodukte, auszuwaschen. Sie wurde mit dem „Dye ExTM 2.0 Spin Kit (Qiagen)“ durchgeführt. Die Röhrchen wurden zunächst „trocken“ für 3 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert, wodurch eine Säule entstand. Auf diese wurden 10 µl des Produktes aufgebracht und, nachdem das Röhrchen in ein frisches Eppendorf-Auffanggefäß gestellt wurde, wieder für 3 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert.
4 µl des nun aufgereinigten Produktes wurden mit 20 µl Formamid in speziell für den ABI Prism 310 Genetic Analyzer vorgesehene Gefäße transferiert. Nach einem kurzen Denaturierungsschritt wurden sie analysiert. Die Auftrennung im Sequenzierer erfolgte bei 50
°C und 15 kV.
Material und Methoden 50 Im Verlauf dieser Arbeit erfolgte eine Umstellung der Verfahren von Einzelreaktionsgefäßen auf die Arbeit mit Mikrotiter-Platten (für die Sequenzierung des SNP 2501432 und seiner benachbarten SNPs, die wegen der Größe der PCR-Produktes sowohl mit dem Foward-, als auch mit dem Reverse-Primer sequenziert wurden). Sie enthalten 96 vorgeformte Vertiefungen für Reaktionsansätze. Für die Aufreinigung dieser Mikrotiter-Platten wurde ein anderes Aufreinigungsverfahren verwendet.
Die erste Aufreinigung erfolgte mit Hilfe des Exo-SAP-IT®-Enzyms (Amershan). 2 µl Enzym wurden mit 5 µl PCR-Produkt für 25 Minuten bei 37 °C und dann für 15 Minuten bei 80 °C inkubiert. Für ein genaueres Arbeiten wurde das aufgereinigte Produkt mit 10 µl HPLC-H2O verdünnt.
Im zweiten Schritt erfolgte ebenfalls die Sequenzierungsreaktion mit Big Dye (s.o.).
Die zweite Aufreinigung erfolgte mit Hilfe einer vorher angefertigten Sephadex-Platte. Dazu wurde Sephadex-Pulver in die Vertiefungen einer mitgelieferten Platte gegeben und mit 300 µl HPLC-H2O vermischt. Die Platte blieb dann über Nacht zum Aufquellen in einem Kühlschrank. Nach Vorbereitung der Sephadex-Platte wurde unter diese die Sequenzierplatte gelegt, deren Vertiefungen mit 20 µl Formamid beschickt waren. Das Produkt aus der Sequenzierungsreaktion wurde in die Reinigungsplatte gegeben und die Platten im Anschluss für 5 Minuten bei 900 g zentrifugiert. Die Sephadex-Platte wurde verworfen und die Sequenzierplatte mit Hilfe des ABI Prism analysiert.
3.5.3 Sequenzierungsbeispiele
Betrachtet man das Sequenzierungsbeispiel in Abb. 10, lassen sich noch keine Haplotypen aufstellen, da sich nicht sagen lässt, welche Basen der heterozygoten SNPs zusammengehören. Erst im Vergleich mit dem zweiten Beispiel ist eine Zuordnung zu den Haplotypen möglich, da hier (mit Ausnahme des SNP 2229579) alle SNPs homozygot sind.
Es wurden noch weitere SNPs im CNR2-Gen sequenziert, die ebenfalls den Haplotypen 1 bis 3 zugeordnet werden können, da sie mit ihnen im Kopplungsungleichgewicht stehen. Da das zu sequenzierende PCR-Produkt mit 783 bp sehr groß ist, wurde jede Probe einmal mit dem Forward-Primer (Abb. 13) und einmal mit dem Reverse-Primer (Abb. 14) sequenziert.
Abb. 10: SNPs 2229579-86 (Kontrollprobe); der SNP 2229579 zeigt einen (C/C)-Genotyp, alle anderen SNPs sind heterozygot, es handelt sich also um die Haplotypen 1 und 2.
Abb. 11: MS-S-Probe mit den Haplotypen 2 und 3. Der einzig heterozygote SNP ist 2229579.
Material und Methoden 52
Abb. 12: SNPs 2229579-86 bei MS-OS-Probe mit homozygotem T-Allel bei SNP 2229579, beide Allele entsprechen dem Haplotyp 3.
Abb. 13: Forward-Sequenzierung der weiteren SNPs im CNR2-Gen
Abb. 14: Reverse-Sequenzierung der weiteren SNPs im CNR2-Gen
Material und Methoden 54 3.6 Längenbestimmung von Allelen
3.6.1 Methode
Mittels PCR wird für den AAT-Repeat (aus der Nukleotidsequenz AL136096) ein Produkt generiert. Dabei ist der Forward-Primer mit einem fluoreszenz-markierten Farbstoff kombiniert worden, so dass nach der PCR jedes Produkt mit einem Farbstoff gekoppelt ist. In dem ABI kann dann mit Hilfe des Argon-Lasers der Farbstoff zum Fluoreszieren angeregt werden und seine Größe in Bezug zu einem gleichzeitig mitlaufenden Standard gesetzt werden. Wenn eine Probe zwei unterschiedliche große Allele hat, sind in dem ABI Prism-Scan zwei Ausschläge zu sehen.
3.6.2 Durchführung
0,5 µl des PCR-Produktes werden mit 16 µl eines Gößenstandards (Tamra) vermischt und kurz denaturiert. Anschließend werden die Proben im ABI Prism 310 Genetic Analyzer nach ihrer Größe getrennt und können anhand des Größenstandards nach den Basenpaar-Größen beurteilt werden. Diese Methode erlaubt nur einen Größenvergleich von Fragmenten und erlaubt keine Rückschlüsse auf die Sequenz. Daher wurden einige verschieden große Proben (mit dem Reverse-Primer) sequenziert, um die Anzahl an AAT-Repeats entsprechend der Fragmentgröße zuordnen zu können.
Abb. 15: Beispiel für die Längenbestimmung bei vier Proben
Auf der oberen Achse sind die Basenpaare angegeben, woraus sich die PCR-Produkt-Größe und damit auch die Anzahl der AAT-Repeats ableiten lassen.
Um die einzelnen Produktgrößen der richtigen AAT-Repeat-Anzahl zuordnen zu können, wurden je eine für die jeweilige PCR-Produktgröße homozygoten Probe sequenziert, z.B. die in dem Abb. 15 in grün dargestellte Probe. Ihre entsprechende Sequenz, die 13 AAT-Repeats enthält, ist in der unteren Abbildung dargestellt.
Abb. 16: Sequenzierung der in Abb. 15 dargestellten Probe
Nach Untersuchung aller Proben können folgende PCR-Produktgrößen der entsprechenden Anzahl an AAT-Repeats zugeordnet werden:
Anzahl Repeats nach PCR-Produktgröße Peaks
7 223 223
10 233 232 - 233
11 236 235 - 236
12 239 238 - 239
13 242 241 - 242
14 245 244 - 245
15 248 247 - 248
Material und Methoden 56 3.7 Statistisches Testen
Die statistische Auswertung der Ergebnisse dieser Arbeit erfolgte mit Hilfe von Fishers exaktem Test (kurz FET). Er wird verwendet beim Testen auf unabhängige Stichproben in der Vierfeldertafel, beim Vergleich zweier Binomialparameter und bei nicht Anwendbarkeit des Chi²-Tests. Der Fisher-Test berechnet kombinatorisch die Wahrscheinlichkeit, mit der die Ungleichgewichte der Tafel rein zufällig entstehen. Wenn in den Vierfeldertafeln Zahlenwerte unter 5 vorkommen, darf nicht mit dem Chi²-Test gerechnet werden. Da dieses öfter der Fall ist, wurde auf den Chi²-Test verzichtet und alle Proben zur besseren Vergleichbarkeit mit Fishers exaktem Test berechnet. Der Chi²-Test ist einfacher zu berechnen, liefert aber auch nur eine ungefähre Schätzung des Ergebnisses, insbesondere bei zwei sehr ungleichen Beobachtungen oder wenn Werte < 5 in die Berechnung mit einfließen. Die Berechnungen nach Fisher neigen dazu, konservativer zu sein als die Berechnungen nach dem Chi²-Test.
Außerdem wurde immer der doppelseitige FET verwendet, da es keine bestimmte vorherige Erwartung bezüglich eines bestimmten Ergebnisses gab.
Somit sind die errechneten Wahrscheinlichkeiten strenger berechnet, als dieses mit dem einfachen Chi²-Test der Fall wäre.
Die Formel für Fishers exakten Test lautet:
r1! x r2! x s1! x s2! P = ---
n! x a! x b! x c! x d!
Dabei steht n für die Gesamtzahl aller Proben; a, b, c, d sind die einzelnen Anzahlen der aufgetretenen Fälle analog den vier Feldern in der Vier-Felder-Tafel, und r bzw. s sind die Summen einer Zeile bzw. Spalte.
Außerdem wurde für viele Proben die Odds ratio berechnet, der Kreuzprodukt-Quotient einer Vier-Felder-Tafel. Da bei einer retrospektiven Studie die Berechnung des relativen Risikos nicht möglich ist, nutzt man die Odds ratio als Schätzwert. Sie ist ein Maß für die Stärke des Unterschieds zwischen zwei Gruppen Dazu wurde jeweils das 95 %-Konfidenzintervall berechnet. Denn nur wenn das Konfidenzintervall die 1 nicht mit einschließt, lassen sich statistisch signifikante Aussagen treffen. Mit Hilfe der Odds ratio lässt sich sagen, welchen
Einfluss ein Faktor auf eine bestimmte Fragestellung hat. Ist die Odds ratio > 1, so ist der Einfluss positiv, oder anders gesagt, das Risiko ist höher, bzw. ist die Odds ratio < 1, so ist der Einfluss negativ oder eben das Risiko der Variant-Gruppe geringer im Vergleich zur Referenzgruppe.
Des Weiteren wurde für alle untersuchten Gruppen das Hardy-Weinberg-Gleichgewicht berechnet. Dieses Gesetz geht von einer Idealpopulation aus und besagt, dass die Allelhäufigkeiten in einem stabilen Gleichgewicht zueinander stehen. Stimmt die nach dem Hardy-Weinberg-Gesetz errechnete Häufigkeit nicht mit dem tatsächlich beobachteten Wert überein, stellt sich die Frage, welche Faktoren zu dem Ungleichgewicht in der Population beigetragen haben oder ob die Beobachtungen auch alle korrekt waren, es also keine Auswertungsfehler, z.B. aufgrund eines unvollständigen Verdaus, der fälschlicherweise als heterozygot eingestuft wurde, gab.
Das Hardy-Weinberg-Gesetz lautet p² + 2pq + q² = 1, wobei p² & q² die Zahl der Homozygoten darstellt und 2pq die Zahl der Heterozygoten. p und q stehen dabei für die jeweilige Allelfrequenz. Beide Allele zusammen ergeben zusammen 100 %, folglich gilt p + q
= 1. Die errechnete Zahl der Heterozygoten ist also 2 x p x q.
Um auch hier eine signifikante Abweichung zu erkennen, wurde ebenfalls das 95 %-Konfidenzintervall bestimmt, in dem der beobachtete Wert von dem errechneten Wert abweichen darf, ohne dass ein mathematisch signifikanter Verstoß gegen das Hardy-Weinberg-Gesetz vorliegt. Stimmen die Werte innerhalb des Konfidenzintervalls überein, liegt der beobachtete Polymorphismus im Hardy-Weinberg-Äquilibrium.
Die Berechnungen erfolgten mit Hilfe der Programme SPSS und Epicalc 2000.
Ergebnisse 58 4. Ergebnisse
Bei den untersuchten Genen handelt es sich um Komponenten des Endocannabinoidsystem.
Um festzustellen, ob dieses System bei der Ausprägung einer Spastik beteiligt ist, wurden drei Kollektive untersucht, ein Kontrollkollektiv aus 50 Personen und zwei MS-Kollektive aus je 41 Personen, wovon eine Gruppe klinisch das Bild einer Spastik bot, die andere dagegen nicht. Mit Hilfe von verschiedenen Restriktionsverdauen bzw. Sequenzierungen wurden Ein-Basen-Polymorphismen auf eine signifikant auffällige Verteilung in diesen Kollektiven getestet. Die Berechnungen der Signifikanzen erfolgten mit Hilfe von Fishers exaktem Test.
Während des Schreibens dieser Arbeit hat sich gezeigt, dass zwei untersuchte SNPs, die laut NCBI direkt den untersuchten Genen zugeordnet wurden, dieses jetzt nicht mehr sind.
Dieses gilt erstens für den SNP 2271316 (G/C) des ALOX12-Gens, seine Position ist auf dem Chromosom 17:6,856,125. Die Position des ALOX12-Gens wird angegeben mit 17:6,840,128-6,854,776, so dass der SNP zwar nahe dem ALOX12-Gen liegt, aber nicht mehr, wie eigentlich beabsichtigt, im Gen selbst. In folgenden Arbeiten sollten daher andere SNPs ausgewählt werden, z.B. rs1126667, rs434473.
Der zweite betroffene SNP ist rs1053627, der zunächst dem FAAH-Gen zugeordnet war, gehört nun aber zu dem MGC22960-Gen (NOL1/NOP2/Sun domain family 4). Die SNP-Position ist 1:46,539,748. Das FAAH-Gen liegt bei 1:46,572,008-46,591,540, so dass auch dieser zwar nahe dem FAAH-Gen ist, aber ebenfalls nicht direkt im Gen selbst liegt.
Dennoch wurden diese SNPs in die Auswertung miteinbezogen, da sie trotzdem aufgrund ihrer Nähe zu den zu untersuchenden Genen bei einer auffälligen Verteilung einen Hinweis auf die Beteiligung des betreffenden Genes geben können.