Aus dem Institut für Humangenetik der Medizinischen Hochschule Hannover
Molekulargenetische Untersuchung zum Zusammenhang des Endocannabinoidsystems
mit Spastizität am Beispiel von Patienten mit Multipler Sklerose
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin in der Medizinischen Hochschule Hannover
vorgelegt von Dennis Wiemann aus Bremen
Hannover im April 2006
Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover
am 23.01.2007.
Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Hochschule Hannover
Rektor: Prof. Dr. med. Dieter Bitter-Suermann
Betreuer: Prof. Dr. med. Manfred Stuhrmann-Spangenberg
Referent: Privatdozentin Dr. Anja Windhagen
Koreferent: Prof.’in Dr. Dorothea Gadzicki
Tag der mündlichen Prüfung: 23.01.2007
Promotionsausschussmitglieder:
Prof. Dr. Hans-Heinrich Kreipe
Prof. Dr. Sebastian Suerbaum
Prof. Dr. Reinhard Brunkhorst
Inhaltsverzeichnis I Seite
1. Einleitung 1
1.1 Multiple Sklerose (MS) 1
1.1.1 Phänomenologie 1
1.1.2 Diagnose 3
1.1.3 Epidemiologie 5
1.1.4 Therapie 6
1.1.5 Neuroanatomische und neurophysiologische Grundlagen der MS 7
1.1.6 Genetik der Multiplen Sklerose 8
1.2 Das Endocannabinoid-System 9
1.2.1 Cannabinoide 9
1.2.2 Biosynthese und Abbau von Endocannabinoiden 12 1.2.3 Rezeptoren des Endocannabinoidsystems 17
1.2.4 Genetik des Endocannabinoidsystems 19
1.3 Zusammenhang zwischen Spastik bei MS und dem Endocannabinoidsystem 21
1.3.1 Grundlagen der Spastik 21
1.3.2 Endocannabinoide und Spastik 23
1.3.3 Bisherige Untersuchungen 24
1.3.4 Modelle und Forschungen an Mausmodellen 25 1.4 Zielsetzung dieser Doktorarbeit 26
1.5 Assoziationsstudien 26
2. Materialen und Geräte 28
2.1 Verwendete Chemikalien 28
2.1.1 Allgemeine Chemikalien 28
2.1.2 Enzyme und biologische Substanzen 28
2.1.3 Kits 29
2.1.4 Standardlösungen, Standardmedien und Puffer 30
2.2 Materialen und Geräte 31
2.2.1 Geräte & Filme 31
2.2.2 Kleinmaterialien 32
2.3 Das Patienten- und das Kontrollkollektiv 32
2.4 Verwendete Software 35
3. Methoden 36
3.1 Extraktion von Nukleinsäuren 36
3.1.1 DNA-Extraktion aus Blut 36
3.1.2 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 37
3.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit DNA 38
3.2.1 PCR mit DNA 38
3.2.2 Verwendete PCR-Ansätze und Programme 40
3.2.3 Auflistung verwendeter Primer 41
3.3 Gelelektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäurefragmenten 43
3.4 Restriktionsverdau 43
3.4.1 Beschreibung der Methode 43
3.4.2 Angewandte Verfahren und Ansätze 45
3.5 Sequenzierung 47
3.5.1 Sequenzierung nach der Methode des „Kettenabbruchs“ 47 3.5.2 Vorbereitung der Sequenzierung am ABI-Sequenzierer 48
3.5.3 Sequenzierungsbeispiele 50
3.6 Längenbestimmung von Allelen 54
3.6.1 Methode 54
3.6.2 Durchführung 54
Inhaltsverzeichnis III
3.7 Statistisches Testen 56
4. Ergebnisse 58
4.1 Berechnungen nach Hardy-Weinberg 59
4.2 Betrachtung der Allelverteilungen 60
4.3 Betrachtung der Genotypen 64
4.4 Zusammengesetzte Genotypen von FAAH-SNPs und MGLL-SNPs 67
4.5 Weitere Auswertungen zum CNR2-Gen 71
5. Diskussion 73
6. Zusammenfassung 79
7. Literaturverzeichnis 80
8. Anhang 95
8.1 Verwendete Abkürzungen 95
8.2 Glossar 97
8.3 Nukleotidsequenzen 99
1. Einleitung
1.1 Multiple Sklerose (MS)
1.1.1 Phänomenologie
Erstmals anatomisch und klinisch beschrieben wurde die Multiple Sklerose (kurz MS, auch als Encephalomyelitis disseminata bezeichnet, ICD 10 G35) in der zweiten Hälfte des 19.
Jahrhunderts von dem französischen Neurologen Jean Martin Charcot (1825-1893) [106].
Während seiner Visiten in dem Pariser Armenkrankenhaus La Salpêtrière fiel ihm auf, dass manche Patienten, während sie ihn seitwärts anblickten, einen Nystagmus bekamen. Wenn sie ihm die Hand reichten, wiesen sie einen Intentionstremor auf und ihre Sprechweise legte auf jede Silbe eine „skandierende“ Betonung. Diese Symptomkombination wurde später als Charcot-Trias bekannt.
Heute geht man davon aus, dass die MS eine multifaktorielle, wahrscheinlich auch autoimmun mitbedingte Erkrankung ist, bei der es schubweise zu einer herdförmigen, perivenösen Infiltration der weißen Substanz mit Lympho- & Plasmozyten kommt, die zu einer Zerstörung des zentralen Myelins führt und damit eine Entmarkung zur Folge hat. Die Defektheilung führt zur herdförmigen, astrozytären Fasergliose, wovon sich der Name Multiple Sklerose ableitet.
Neben den Symptomen des cerebellären Systems (Charcot-Trias), bestehend aus Nystagmus, Intentionstremor und skandierender Sprache, ist eine Vielzahl von weiteren Symptomen möglich, die sich je nach Lokalisation der Herde im Gehirn oder Rückenmark äußern. Sie können bei dem einen mehr, bei dem anderen weniger ausgeprägt sein, anhalten oder bleiben, sich aber auch völlig oder nur teilweise wieder zurückbilden. Die alten Symptome können immer wieder auftreten. Es können neue hinzukommen, dann spricht man von "Schub". Wenn sie sich zurückbilden, spricht man von "Remission". Unterschieden werden drei Formen der MS: schubförmig, primär progredient und sekundär progredient.
Klinisch beginnt die MS bei über 80% der Patienten mit einem schubförmigen Verlauf.
Unbehandelt kommt es bei ca. 40% der Patienten nach 10 Jahren zu einer sekundären Progredienz, d.h. es kommt zu einer schleichenden Zunahme klinischer Symptome auch ohne einen eindeutigen Schub. Lediglich ein geringer Anteil von Patienten beginnt bereits mit einer
Einleitung 2 schleichenden Zunahme neurologischer Symptome und hat im Verlauf der Erkrankung keine Schübe. Dieses wird als primär progredienter Verlauf bezeichnet. Übergangsformen wurden beschrieben.
Weitere typische Symptome sind eine ein- oder doppelseitige Sehnervenneuritis oder die retrobulbäre Optikusneuritis. Flüchtige Augenmuskellähmungen mit Doppelbildern sind ebenso wie die internukleäre Ophthalmoplegie, die oft doppelseitig auftritt, charakteristisch.
Typische Funktionsstörungen der übrigen Hirnnerven betreffen den N. facialis (Facialisparese) und den sensiblen Trigeminus (Trigeminusneuralgie). Die kaudalen Hirnnerven bleiben fast immer frei. In 70 % der MS-Fälle sind die Bauchhautreflexe abgeschwächt oder erloschen (ein wichtiges Frühsymptom). An Sensibilitätsstörungen finden sich Missempfindungen, Taubheit oder Kribbeln, vor allem in Händen und Füßen. Auch Blasenstörungen sind nicht selten. Im psychischen Befund zeigt sich bei cerebraler MS- Lokalisation oft eine Euphorie, die sich häufig durch das Fehlen einer Betroffenheit über die Krankheit und eine optimistische Einstellung zum Verlauf äußert. Jedoch auch die Entwicklung einer Depression ist möglich. Im Verlauf der Erkrankung kann es zur Demenz kommen. Weiterhin belastend für die Patienten ist eine teilweise ausgeprägte Müdigkeit. An motorischen Symptomen finden sich häufig zentrale Paresen (insbesondere spastische), wobei die distalen Extremitäten stärker betroffen sind als die proximalen. Das so genannte Uhthoff- Phänomen beschreibt eine Abhängigkeit der Leitfähigkeit zentraler Leitungsbahnen von der Temperatur. Dabei kommt es zu einer vorübergehenden Verschlechterung durch Wärme, Abkühlung dagegen verbessert die Symptome. Das Phänomen ist sehr variabel ausgeprägt.
Alle Symptome können grundsätzlich wahllos miteinander auftreten, es gibt jedoch einige typische Kombinationen, die häufig wiederkehren:
- Gefühlsstörungen an den Händen und spastische Paraparese der Beine - spastisch-ataktischer Gang mit Missempfindungen und Blasenstörungen
- inkomplettes Querschnittssyndrom mit Nystagmus und skandierendem Sprechen - rezidivierende, flüchtige Lähmungen wechselnder Augenmuskelnerven
1.1.2 Diagnose
Der klinische Verdacht auf eine MS ergibt sich häufig aus dem schubweisen Verlauf und der multilokulären Verteilung der Symptome.
In mehr als 90 % der Fälle finden sich Veränderungen im Liquor. Typisch sind eine leichte lymphozytäre Pleozytose und das Auftreten von Plasmazellen, die normalerweise nicht im Liquor zu finden sind. Des Weiteren kann eine leichte Gesamteiweißerhöhung auftreten, oft besteht aber nur eine relative Vermehrung der IgG-Fraktion. Ein Eiweißquotient Liquor zu Serum von über 0,8 zeigt eine lokale IgG-Produktion an. Diese können als oligoklonale Banden mittels Immunfixation nachgewiesen werden, sie sind allerdings nicht sehr spezifisch für die MS, sondern treten auch bei vielen anderen ZNS-Infektionen oder Vaskulitiden auf.
Pathologisch verzögerte Antwortpotentiale lassen sich elektrophysiologisch mittels visuell-, akustisch-, sensibel- oder motorisch evozierten Potentialen nachweisen.
Serologisch werden anti-MOG-(myelin oligodendrocyte glycoprotein) und anti MBP-(myelin basic protein)-Antikörper bestimmt.
Die Bildgebung ist oft mehrdeutig, so dass eine Diagnose nicht allein darauf gestellt werden kann. Im Computertomogramm findet sich eine Minderung des Hirnvolumens. Wichtiger ist die Kernspintomographie, die auch zeigen kann, dass die Aktivität der MS in jedem Stadium weiter größer ist, als der neurologische Status vermuten lässt. Mit Hilfe von kontrastverstärkenden Substanzen (Gadolinum) lassen sich Schrankenstörungen in Entzündungsherden nachweisen. Bei Patienten mit primär progredienter Verlaufsform sind MRT-Läsionen seltener.
Einleitung 4 Im Folgenden sind die aktuellen Diagnosekriterien der MS nach McDonald et. al. (2001) [92]
aufgeführt:
Klinische Präsen- tation (Schübe)
Objektivierbare klinische Läsion
Weitere erforderliche Kriterien
2 oder mehr 2 oder mehr Keine; klinische "Evidenz" ausreichend (zusätzliche
„Evidenz" wünschenswert und muss dann mit MS vereinbar sein)
2 oder mehr 1 räumliche Dissemination im MRIA
oder positiver LiquorbefundB & 2 oder mehr MS typ.
Läsionen im MRI
oder weiterer klinischer Schub 1 2 oder mehr zeitliche Dissemination im MRIC
oder zweiter klinischer Schub 1 (monosymptomatische
Präsentation)
1 räumliche Dissemination im MRIA oder 2 oder mehr MS typ. Läsionen im MRI mit positivem LiquorbefundB UND zeitliche Dissemination im MRIA oder zweiter klinischer Schub
0 (primär progredienter Verlauf)
(Thompson et al., 2000)
1 positiver LiquorbefundB UND räumliche Dissemination im MRI > 9 T2 Läsionen im Gehirn
oder >2 Läsionen im RM
oder 4-8 cerebrale + 1 RM-Läsionen
oder positive VEPsD + 4-8 cerebrale MRT Läsionen oder positive VEPsD + = 4 cerebrale MRT Läsionen + 1 RM-Läsion
UND zeitliche Dissemination im MRIC kontinuierliche Progression für 1 Jahr
A Demonstration räumlicher Dissemination muss entsprechende Kriterien nach Barkhof (1997) & Tintoré (2000) erfüllen
B Ein positiver Liquorbefund liegt beim Nachweis oligoklonaler Banden bzw. eines erhöhten Liquor-IgG-Index vor.
C MRI Kriterien für eine zeitliche Dissemination: Kontrastmittel aufnehmende Läsion > 3 Monate nach klinischem Schub an anderer Lokalisation als vorangegangener Schub oder neue Kontrastmittel aufnehmende oder T2w- hyperintense Läsion in einem zweiten MRI im Abstand von > 3 Monaten
D Pathologische visuell evozierte Potentiale, typisch für die MS (Latenzverzögerung bei gut erhaltener Konfiguration)
1.1.3 Epidemiologie
Bei der Multiplen Sklerose handelt es sich um eine der häufigsten organischen Erkrankungen des Nervensystems. In Mitteleuropa wird die Inzidenz mit 3-7 Erkrankten (in Deutschland etwa 6), die Prävalenz mit 30-60 pro 100.000 Einwohner angegeben. Von den in Neurologischen Kliniken behandelten Patienten leiden ca. 8 % an MS. Das Geschlechterverhältnis Frauen zu Männern beträgt 3:2. Dabei Frauen erkranken etwa doppelt so häufig wie Männer an der schubweisen Verlaufsform, die Verteilung für die chronisch progrediente MS ist dagegen gleich.
Eine besondere Bedeutung hat die geographische Verteilung der MS. Mit wachsender Entfernung vom Äquator nimmt die Erkrankungshäufigkeit bei der weißen Rasse zu. Es besteht also ein deutliches Nord-Süd-Gefälle. In Europa ist die MS oberhalb des 46.
Breitengrades häufiger als darunter. Auch in den USA ist sie in den nördlichen Bundesstaaten oberhalb des 38. Breitengrades stärker vertreten als in den Südstaaten.
Bei den Inuit und den Bantu kommt die MS gar nicht oder nur extrem selten vor und bei auch Orientalen ist sie etwa 10mal seltener als bei Bevölkerungsgruppen nordeuropäischen und nordamerikanischen Ursprungs in vergleichbarer geographischer Lage.
Einwanderer, die ihr Geburtsland im frühen Kindesalter verlassen, nehmen das Erkrankungsrisiko ihres neuen Heimatlandes an. Wechseln sie ihren Wohnort nach der Pubertät (um das 15. Lebensjahr), nehmen sie das Risiko ihres Ursprungslandes mit. In der zweiten Generation verwischt dieser Unterschied.
Das Manifestationsalter liegt zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr, sie kann aber auch schon in der Pubertät auftreten. Jenseits des 45. Lebensjahres nimmt die Häufigkeit von Neuerkrankungen kontinuierlich ab.
Einleitung 6 1.1.4 Therapie
Eine wirksame bzw. kausale Therapie der MS gibt es derzeit nicht. Als Standardtherapie des akuten MS-Schubes gilt die intravenöse Applikation von hochdosiertem Methylprednisolon [47][48][66] oder ACTH. Jedoch können dadurch nur die Entzündung und die Schwellung im akuten Schub reduziert, ein Einfluss auf weitere Schübe oder auf die (Prävention der) Entstehung einer Gliose besteht dagegen nicht. Bei einem klinisch schweren Schub, der nicht ausreichend auf Kortikosteroid-Pulstherapien anspricht, kann eine zusätzliche Behandlung mit Plasmapherese in Erwägung gezogen werden [67][140].
Beim schubförmigen Verlauf werden Azathioprin, Interferone und Immunglobulin G eingesetzt, um die Anzahl und Intensität der Schübe zu reduzieren.
Beim chronisch progredienten Verlauf mit rasch zunehmender Invalidisierung bestehen dagegen Indikationen für Methotrexat, Cyclophosphamid und Mitoxantron.
Weitere therapeutische Ansätze beschränken sich zumeist auf eine symptomatische Therapie.
Zur Behandlung der Spastik (vgl. Abschnitt 1.3.1) kommt als Mittel der ersten Wahl Baclofen oder Tizanidin in Betracht. Bei einer oral nicht ausreichenden Therapie kann auch eine subkutane Implantation einer Baclofenpumpe mit intrathekaler Applikation erfolgen. Mittel der zweiten Wahl sind unter anderem Clonazepam oder Diazepam. Auch eine lokale Behandlung der Spastik mit Botulinumtoxin ist möglich und wird in Spezialambulanzen angeboten. Bei zugleich bestehender Depression ist eine zusätzliche Muskelrelaxation durch Antidepressiva möglich (Amitryptilin, Maprotilin, Doxepin).
1.1.5 Neuroanatomische und neurophysiologische Grundlagen
Die Multiple Sklerose ist eine Entmarkungskrankheit. Sie befällt vorwiegend die weiße Substanz des gesamten ZNS. Es kommt zu herdförmigen Schädigungen oder zu Auflösung der Myelinscheiden (Demyelinisierung), die von Oligodendrozyten gebildet werden. Diese Herde imponieren makroskopisch anfangs als weiche, grau-rötliche Plaques, im Verlauf werden sie jedoch hart und grau als Folge der Astrozytenproliferation. Autoreaktive T- Lymphozyten werden peripher aktiviert, z.B. durch einen Virusinfekt und erzeugen nach Penetration der Blut-Hirnschranke durch lokale Antigenpräsentation und Stimulation eine Myelinschädigung durch Zytokine, Entzündungsmediatoren, zytotoxische Zellen und Autoantikörper. Ohne diese Markscheiden ist die normale Nervenleitung erschwert bis unmöglich. Auch B-Lymphozyten werden aktiviert.
Die Entmarkungsherde, auch Plaques genannt, sind in verschieden groß, von der Größe eines Stecknadelkopfes bis hin zu münzgroßen Herden. Sie finden sich verteilt über das gesamte ZNS, bevorzugt um oder entlang von größeren Venen und in der Umgebung der Seitenventrikel, wo sie bevorzugt zu größeren Herden konfluieren können.
Einleitung 8 1.1.6 Genetik der MS
Eine eigentliche Ursache der MS ist bis heute nicht bekannt. Sie wird heute als multifaktorielle Erkrankung verstanden, wobei neben dem Geschlecht auch hormonellen und Umweltfaktoren eine Rolle zugeschrieben werden. Neben der Slow-Virus-Hypothese oder der Hypothese einer Autoimmunerkrankung gibt es auch eine Vielzahl an Untersuchungen zur genetischen Prädisposition der MS.
Die Konkordanzrate bei monozygoten Zwillingen beträgt ca. 25 %, bei dizygoten 3 % [21][142]. Auch bei Geschwistern von MS-Patienten besteht eine Lebenszeit- Erkrankungswahrscheinlichkeit von 3-5 %. Bei Halbgeschwistern beträgt dieses Risiko nur noch 1,3 %. Angehörige ersten Grades haben ein 20fach höheres Erkrankungsrisiko. Diese Befunde weisen auf eine nicht unerhebliche Bedeutung erblicher Faktoren in der Entstehungsgeschichte der MS hin. Jedoch scheint angesichts der eher niedrigen Wahrscheinlichkeiten der Einfluss anderer, äußerer Faktoren bedeutsamer zu sein.
Des Weiteren ist eine Assoziation der MS mit bestimmten MHC-Antigenen der Klasse I oder II schon seit drei Jahrzehnten bekannt [63]. Am besten gesichert ist eine starke Assoziation mit HLA-DR 2 [DRB1*1501] & HLA-DQ 6 [104]. Auch andere HLA-Antigene (HLA-DR 3, DR4) zeigen einen Zusammenhang mit der MS [87][88].
Aber auch andere genomische Regionen stehen im Verdacht, mit MS assoziiert zu sein, am auffälligsten ist bisher eine Region auf Chromosom 17q22-24 [39], in der eine Assoziation mit der Proteinkinase C alpha nachgewiesen wurde [9].
In einigen deutschen Studien konnte eine Assoziation der MS mit einer Mutation des CD45- Moleküls nachgewiesen werden [62]. Dabei handelt es sich um ein transmembranäres Zelloberflächenprotein auf allen hämatopoetischen Zellvorläufern und auch auf allen reifen Zellen des peripheren Blutes mit Ausnahme von Erythrozyten. Doch konnten weitere Studien im Verlauf diese Assoziation nicht bestätigen, darunter auch eine Studie mit einem weiteren Kollektiv deutscher MS-Patienten [99].
Es lässt sich insgesamt feststellen, dass es keinen genetischen Hauptort für die MS zu geben scheint, dennoch sind viele Gene mit ihr verbunden [37].
1.2 Das Endocannabinoid-System
1.2.1 Cannabinoide
Cannabinoidzubereitungen werden seit Jahrhunderten als Heilmittel in verschiedenen Kulturen verwendet. Sie werden aus der Hanfpflanze Cannabis sativa gewonnen, deren botanischer Ursprung sich in Zentralasien findet. Über China und Indien breitete sich der Anbau der Pflanze in der islamischen Welt aus. Im frühen 19. Jahrhundert erreichte sie Mitteleuropa [119], wo sie zunächst vor allem in Künstlerkreisen sehr beliebt war. Neben ihrer Verwendung als Heilmittel spielt Cannabis vor allem im Bereich der illegalen Drogen (Marihuana, Haschisch) eine bedeutsame Rolle. In den letzten Jahrzehnten hat Cannabis einen Wandel von der Droge der Protestbewegung der 1960er Jahre zu einer „Lifestyle-Droge" der jugendlichen Konsumenten heute durchgemacht.
Der stärkste psychoaktiv wirkende Bestandteil von Cannabis sativa ist das Δ9-Tetrahydrocannabinol, kurz Δ9-THC genannt (s.
rechts). Die Wirkungen von Cannabinoiden sind sehr unterschiedlich. Zentral wirken sie entspannend und dämpfend, verändern die Wahrnehmung und rufen Gefühle von Euphorie und Losgelöstsein hervor, es werden aber auch unangenehme
psychische Wirkungen beschrieben [50]. Psychotische Bilder nach Cannabiskonsum sind nicht selten. Dabei reicht das Spektrum von Ängstlichkeit und Depression über Panik, Realitätsverlust und Depersonalisation bis hin zu paranoiden Zuständen und Psychosen [64][120]. Die Wirkungen sind aber nicht nur auf die kognitiven und emotionalen Funktionen beschränkt. Auch in der Kontrolle und Steuerung von Sensomotorik und Motivation spielen sie eine Rolle [43]. So bewirken sie in niedriger Dosierung Hypoaktivität, eine Dosissteigerung dagegen führt zur Bewegungssteigerung bis hin zur Katalepsie [118].
Aufgrund ihrer antikonvulsiven Eigenschaften stelle sie potentielle Antiepileptika dar [2][65].
In der Schmerzwahrnehmung scheinen sie eine wichtige Rolle in der Physiologie und Pathophysiologie der Modulation von Schmerzen zu spielen [107]. Daher werden sie auch oft als Analgetika eingesetzt [58]. Auch Gedächtnisprozesse werden vor allem durch Anandamid (s.u.) beeinflusst [78]. Des Weiteren wirken Cannabinoide verstärkend auf den Appetit [27].
Die Endocannabinoide im Hypothalamus stehen unter teilweiser Kontrolle des Hormons
Einleitung 10 Leptin, das die Nahrungsaufnahme moduliert. Diese Tatsache macht man sich bei konsumierenden Erkrankungen, z.B. beim HIV wasting syndrome zu nutze [53][133].
Aber die Wirkungen sind nicht nur auf kognitive und emotionale Wirkungen beschränkt. Auf die Gefäße lässt sich eine hypotensive und gefäßrelaxierende Wirkung nachweisen [114].
Endocannabinoide haben immunsuppressive, aber auch zytotoxische und antiproliferative Eigenschaften [105][135]. Die Immunmodulation erfolgt vor allem über CB2-Rezeptoren (siehe auch Abschnitt 1.2.3). Interessant sind auch Studien, die eine neuroprotektive Wirkung von Endocannabinoiden zeigen. Bei Gabe nach einem Schädelhirntrauma kann eine deutliche Reduzierung der Hirnschäden erreicht werden [13][95]. Es kommt zu einer Verminderung der neurotoxischen Glutamatfreisetzung [52]. Das Infarktvolumen verkleinert sich, das Hirnödem reduziert sich signifikant und auch die Anzahl zerstörter hippokampaler Zellen ist geringer.
An diesen Effekten sind unter anderem auch Lipoxygenaseprodukte von Anandamid beteiligt, die so genannten Hydroxy-N-Arachidoylethanolamine, kurz 12- und 15-HAEA [137].
Auch auf die Reproduktionsprozesse scheint vor allem Anandamid einen Einfluss zu nehmen, besonders auf die Regulation der Implantation der Eizelle [49]. Ein neueres Endocannabinoid, Virodhamin, ein Antagonist für Anandamid in dessen Anwesenheit, greift am CB1-Rezeptor in die Temperaturregulation ein. In einem Mausmodell [126] produzierte es Hypothermie.
Auch für die Glaukomtherapie sind Endocannabinoide geeignet. Mit Hilfe eines synthetischen Abkömmlings lässt sich der Augeninnendruck senken, auch bei Patienten, die resistent gegenüber konventionellen Therapien sind [111].
Nach der Entdeckung der Cannabinoidrezeptoren 1988 [31] in Hirngewebe von Ratten, folgte 1992 der erste Nachweis eines körpereigenen Rezeptorliganden [32], dem Anandamid. 1995 konnte ein zweiter körpereigener Ligand, das 2-Arachidonylglycerol (2-AG) identifiziert werden [94], das in großen Mengen im Gehirn nachgewiesen werden konnte [127][131].
Die Freisetzung von Endocannabinoiden erfolgt bei Bedarf durch nach zellulärer Depolarisation oder nach Rezeptorstimulation. Einmal
produziert wirken sie auf die umliegenden Cannabinoidrezeptoren, so dass man sie als lokale Mediatoren verstehen kann.
Mittlerweile ist eine Vielzahl von verschiedenen Liganden der Endocannabinoidrezeptoren bekannt. Dabei kann zwischen endogenen, natürlichen und künstlichen Cannabinoiden unterschieden werden. Die wichtigsten Vertreter der
endogenen Cannabinoide sind Anandamid (obere Strukturformel in Abb. 2), das seine Wirkungen vor allem als CB1-Rezeptor-Agonist entfaltet, und das 2-AG (untere Strukturformel in Abb. 2), das vor allem am CB2-Rezeptor wirkt (genaue Wirkungen siehe Abschnitt 1.2.3). Weitere Vertreter sind das bereits erwähnte Virodhamin [112], Noladinether, das wie Virodhamin im Mausmodell zu Hypothermie, aber auch zu Sedation, intestinaler Immobilität und leichter Hemmung der Schmerzwahrnehmung führt [53] und wahrscheinlich ein Agonist an beiden Cannabinoidrezeptoren ist [122], sowie N-Palmitoylethanolamin, das häufigste der Endocannabinoide [81], dessen Aktivität derzeit noch nicht vollständig geklärt ist. Am CB2-Rezeptor ist es vermutlich ein inaktiver Ligand [130]. Für den VR1-Rezeptor gelten neben den Endocannabinoiden Capsaicin und Arvanil-2 als Agonisten, als Antagonist wirkt Capsazepin.
An natürlichen Cannabinoiden sind bisher das Δ9-Tetrahydrocannabinol, das als Dronabinol in den USA als Medikament zugelassen ist, bekannt, sowie das Cannabidiol, welches im Gegensatz zu Δ9-THC nicht psychoaktiv wirksam ist. Es fungiert als Agonist am CB1- Rezeptor.
Synthetische Liganden sind vor allem für experimentelle und pharmakologische Anwendungen interessant. Agonisten am CB1-Rezeptor sind HU-210, welcher derzeit im Rahmen von Forschungsprojekten zur Neuroprotektion oder Darmentzündungen eingesetzt wird [77][89], WIN55,212-2, ebenfalls eingesetzt zu Forschungszwecken (Analgesie) [128][139] und CP55940, mit dessen Hilfe z.B. der Einfluss der Cannabinoide auf Natrium- Kanäle erforscht wird [91].
Als CB1-Antagonisten sind derzeit bekannt: SR141716A, derzeit genutzt zur Erforschung von Anxiolyse, aber auch zur Gewichtsreduktion und Entwöhnung bei Nikotinabhängigkeit im Rahmen eines metabolischen Syndroms [38][51][76]; AM630 [147] und AM281, eingesetzt in der Grundlagenforschung, unter anderem bei Interaktionen des Endocannabinoidsystems mit anderen Neurotransmittern [41][102][141] und zur Bildgebung [11]; LY320135, der zur Erforschung des Einflusses von Cannabinoiden auf Blutgefäße verwendet wird [22][24].
Auch für den CB2-Rezeptor sind synthetische Liganden bekannt, wobei die Agonisten meist auch am CB1-Rezeptor binden, wie z.B. WIN55,212-2. Agonisten mit einer hohen Affinität zum CB2-Rezeptor sind z.B. JWH-015, L768242 JWH-133 [61]. Ein bekannter synthetischer Antagonist ist SR144528, derzeit angewendet zur Erforschung der Modulation neuraler Prozesse durch Cannabinoide [144].
Einleitung 12 1.2.2 Biosynthese und Abbau von Endocannabinoiden
Endocannabinoide sind chemisch gesehen ungesättigte Fettsäuren und entstammen dem Phospholipidstoffwechsel der Plasmamembranen. Sie werden zu der Familie der Eicosanoide gezählt, die Gewebsmediatoren darstellen, welche an einer Reihe von physiologischen und pathologischen Prozessen (Blutgerinnung, Vasodilatation Entzündungsregulation, u. a.) beteiligt sind. Beispiele für weitere Eicosanoide sind Prostaglandine, Prostazykline, Thromboxane und Leukotriene. Ihre Grundstrukturen leiten
sich alle, wie auch die der Endocannabinoide, von der Arachidonsäure (siehe Grafik rechts) ab. Eine Reihe von Medikamenten greift in den Eicosanoid-Stoffwechsel ein, die bekanntesten Vertreter sind die Inhibitoren der
Cyclooxygenase 1, wie z.B. die nichtsteroidalen Antiphlogistika (ASS, Ibuprofen, Diclofenac, etc.) und spezifische COX2-Hemmer (Celecoxib).
Die Endocannabinoide existieren lediglich in pmol/g Konzentrationen im zentralen Nervensystem. Dabei werden sie von Neuronen synthetisiert und ihre Freisetzung erfolgt durch Depolarisation der Zelle. Anschließend werden sie rasch aus dem Extrazellularraum entfernt. Sie werden nicht wie andere Neurotransmitter in Vesikeln gespeichert, sondern bei Bedarf generiert. Im Folgenden sollen die einzelnen Schritte dieser Vorgänge näher erläutert werden.
Für die Biosynthese von Anandamid (Sanskrit, ananda = Glückseligkeit) sind zwei Stoffwechselwege bekannt. Der hauptsächlich genutzte Weg beginnt in der oberen Zellmembran. N-Arachidonyl-Phosphatidylethanolamin (NAPE) wird erzeugt durch den Transfer von Arachidonsäure aus der sn-1 Position des 1,2-sn-di- Arachidonylphosphatidylcholin (diArPC) zum Phosphatidylethanolamin. Diese Reaktion wird katalysiert durch eine Phosphodiesterase (Transacylase, N-Acetyltransferase), ein Schritt, der kalziumabhängig ist. Dieser Weg ist auch der Hauptsyntheseweg für verschiedene andere N- Acylethanolamide wie z.B. N-Palmityl- und N-Stearylethanolamid. In einem weiteren Schritt wird dann durch eine Phosphodiesterase (Phospholipase D, sie ist spezifisch für NAPE) Phosphatsäure abgespalten und es entsteht N-Arachinodylethanolamin, auch Anandamid genannt.
Die zweite und weniger wichtige Variante ist die direkte N-Acylierung von Ethanolamid und Arachidonsäure durch die FAAH, die eigentlich für den Abbau von Anandamid zuständig ist
(s.u.). Sie katalysiert aber bei einer genügend hohen Konzentration von Arachidonsäure und Ethanolamid dessen Synthese, ein aber eigentlich unphysiologischer Zustand.
2-Arachidonylgycerol, ein Arachidonsäureester [129] wird ebenfalls auf unterschiedlichen Wegen gebildet. Der erste, bevorzugte Weg besteht zunächst aus einer schnellen Hydrolyse des Phosphatidylinositols (PI) durch eine Phospholipase C. Er entspricht derselben Kaskade, die auch verantwortlich ist für die Bildung der Second messenger (zweiter Botenstoff einer Hormonwirkung) 1,2-Diacylglycerol und Inositoltrisphosphat. Die nachfolgende Hydrolyse des daraus entstandenen Diacylgylerols erfolgt durch die sn1-Diacylglycerol-Lipase [14]. Bei dem zweiten Weg wird das PI zunächst durch die Phospholipase A 1 zu einem Lysophospholipid hydrolysiert und anschließend durch eine Phospholipase C zu 2-AG umgewandelt. Es wurde noch ein möglicher dritter Weg beschrieben. Dabei entsteht das 2- AG aus der Konversion von 2-Arachidonyl-Lysophosphatsäure (2-AG-LPA).
Einleitung 14
Der Abbau von Endocannabinoiden erfolgt intrazellulär nach Aufnahme in die Zelle. Wie genau sie nach intrazellulär gelangen, ist noch nicht genau geklärt. Möglicherweise erfolgt sie über einen (umstrittenen) Transporter (Anandamid-Membran-Transporter = AMT), aber auch Modelle der erleichterten (carriervermittelten) oder einer passiven Diffusion sind in der Diskussion.
Die Sättigungskinetik erbringt Werte [10], die denen sehr ähnlich sind, die mit den Transportvorrichtungen für Serotonin, Dopamin und Noradrenalin erreicht werden. Höhere Werte für einen Anandamidtransport wurden jedoch in den cerebellären Körnerzellen [57], die für eine erleichterte Diffusion sprechen, gemessen. Auch dafür spricht, dass der Transport keine zelluläre Energie benötigt [10][57]. Gesteuert werden könnte der Prozess durch die intrazelluläre Aktivität der FAAH [45]. Die selektive Hemmung des Anandamidtransportes kann erreicht werden durch eine kompetitive Hemmung mittels AM404 und anderen Anandamidabkömmlingen [10][30][57][80]. Allerdings ist es auch möglich, den Anandamidtransport unabhängig von der FAAH zu hemmen [30][80]. Mittlerweile gibt es
auch Hinweise auf einen makromolekulären Erkennungsort [110]. Eine endgültige Klärung, beispielsweise durch eine molekulare Charakterisierung, ist bisher nicht erfolgt.
Sowohl Anandamid als auch 2-AG können über die FAAH (Fatty acid amino hydrolase) abgebaut werden. Bei diesem Enzym handelt es sich um eine membrangebundene Serin- Hydrolase, die Anandamid in Ethanolamid und Arachidonsäure [33][56] bzw. 2-AG in Glycerol und Arachidonsäure spaltet [28]. Dieses ist für beide Endocannabinoide wahrscheinlich der Hauptabbauweg. Es gibt aber auch noch andere Möglichkeiten.
Anandamid kann über Lipoxygenasen zu Hydro(pero)xy-Anandamiden, 12- und 15-HAEA, umgewandelt werden. Diese Stoffe sind wirkungsvolle Inhibitoren der FAAH [83]. Außerdem scheinen sie die neuroprotektiven Wirkungen von Endocannabinoiden beeinflussen zu können, wobei sie in vivo keinen Einfluss auf Anandamid und seine Wirkungen haben [137].
Auch über die Cyclooxygenase 2 (COX2) entstehen Metabolite von Anandamid, die jedoch nicht die FAAH inhibieren.
Der Abbau von 2-AG kann alternativ zur FAAH auch über die Monoacylglycerollipase (MGLL) erfolgen. Es ist eine zytosolische Serin-Hydrolase, die im ZNS eine ähnliche Verteilung wie die FAAH aufweist, wobei die FAAH vor allem in postsynaptischen Strukturen nachweisbar ist, die MGLL dagegen vorwiegend in Nervenendigungen [36]. Im Hippocampus (CA1-Feld) umgeben MGLL-haltige Axone Zellkörper von Pyramidalneuronen, die FAAH enthalten. Diese Anordnung könnte eine beispielhafte Erklärung für die präsynaptische Terminierung eines 2-AG-Signals durch die MGLL im Sinne einer retrograden Signaltransduktion sein. Weiterhin kann 2-AG nicht nur durch katabole Enzyme verstoffwechselt werden, sondern auch durch anabole, z.B. durch Kinasen, die 2-AG in 2-Arachidonyl-LPA umsetzen. Dieser Weg hat Bedeutung für die Wiederverwertung von 2-AG, z.B. als Phosphatidylinositols (PI). Auch weitere Metabolisierungen von 2-AG wurden beschrieben, unter anderem die Oxygenierung durch die COX2 und Lipoxygenasen (ALOX12, ALOX15) [71][72][73][100].
Die in den Abbauprozessen freigesetzte Arachidonsäure wird sofort in die Zellmembran reintegriert.
Einleitung 16
Abb. 6: Schema des Endocannabinoid-Abbaus
Legende: Gelbe Pfeile stellen Endocannabinoidtransport durch die Zellmembran dar, rote Pfeile mögliche Abbauwege.
1.2.3 Rezeptoren des Endocannabinoidsystems
Im Folgenden soll auf die bisher bekannten Rezeptoren des Endocannabinoidsystems näher eingegangen werden, da sie in dieser Arbeit einen Großteil der untersuchten Gene darstellen.
Zurzeit sind drei Rezeptoren bekannt, die Cannabinoidrezeptoren 1 und 2 (CB1, CB2) und der Vanilloidrezeptor VR1.
Bei CB1 und CB2 handelt es sich um G-Protein-gekoppelte Rezeptoren [59]. Die Signalwege beinhalten die Hemmung einer Adenylatzyklase und damit die Umsetzung von Adenosinmonophosphat (AMP) in cAMP, dem cyklischen AMP, die Regulation von Ionenkanälen (Inhibition von Kalziumkanälen des N-, P/Q- und L-Typs und Aktivierung von spannungsabhängigen, einwärtsgerichteten Kalium-Kanälen vom Typ A) und die Kopplung an mitogen-aktivierte Proteinkinase [82]. Dabei arbeitet das Endocannabinoidsystem nach dem Prinzip der retrograden Signalübertragung [84][143]. Setzt ein postsynaptisches Neuron durch Depolarisation Endocannabinoide frei, gelangen diese durch den synaptischen Spalt zur präsynaptischen Nervenendigung, wo sie an CB1-Rezeptoren binden und so eine Reduktion der Transmitterfreisetzung bewirken. Dadurch wird den Neuronen eine Feinabstimmung zwischen exzitatorischen (z.B. Glutamat-vermittelten) und inhibitorischen (z.B. GABA- vermittelten) Impulsen ermöglicht [5,69].
Beide Rezeptoren ähneln sich in ihrer Struktur, sie sind zu 44 % identisch. In den Transmembrandomänen besteht sogar eine 68 %ige Übereinstimmung
Der CB1-Rezeptor findet sich vor allem in zentralen Neuronen (motorische Areale und Basalganglien, Hippocampus und Cerebellum) [144], aber auch in peripheren Neuronen (hier vor allem in sensorischen Neuronen der Spinalganglien) und Organen (endokrine Drüsen, Herz, Milz, Gastrointestinaltrakt und in Teilen des Reproduktionssystems. Er ist ein präsynaptisch angeordnetes, integrales Membranprotein, dessen transmembraner Anteil aus sieben hydrophoben Domänen besteht. Sein Amino-Ende ist extrazellulär, das Carboxylende intrazellulär gelegen [90]. Insgesamt besteht er aus 472 Aminosäuren. Über die CB1- Aktivierung werden mehrere Effekte vermittelt. Dazu gehört die Inhibition der Ausschüttung von Neurotransmittern (GABA, Glutamat, Dopamin) aus präsynaptischen Nervenendigungen [60], die durch den Verschluss der Kalziumkanäle bedingt ist. Durch den Kaliumausstrom aus der Präsynapse kommt es zu einer Hyperpolarisation der Zellmembran, wodurch sie die Erregbarkeit der Zelle vermindert.
Einleitung 18 Zu den β-Rezeptoren des noradrenergen Systems sowie zu den Dopamin-Rezeptoren steht das Cannabinoidsystem in Interaktion. CB1-Rezeptoren sind auf striatonigralen Neuronen mit Dopamin(D1)-Rezeptoren und auf striatopallidalen Neuronen mit Dopamin(D2)-Rezeptoren gemeinsam vorhanden [46][85]. Dieses führt letztendlich zu einer negativen Kontrolle der aktivitätssteigernden Effekte des noradrenergen und dopaminergen Systems. Auch eine Untersuchung mit CB1-knock-out-Mäusen [126] lässt auf eine entscheidende Bedeutung des CB1-Rezeptors auf Bewegungsabläufe schließen. Diese Mäuse zeigten im Ergebnis eine grundsätzliche Bewegungsabnahme. Hier könnte sich ein Ansatz für die Wirkung von Endocannabinoiden auf Spastik finden lassen.
Der CB2-Rezeptor kommt auf Immunzellen, wie B-Lymphozyten, T-Lymphozyten, Makrophagen und natürlichen Killerzellen vor. Über ihn entfalten die Endocannabinoide ihre immunsuppressiven Wirkungen [43][116], die auch Einfluss auf die Entwicklung von T- Helferzellen nehmen [70]. Weitere immunsupprimierende Wirkungen reichten von der Reduktion der Infektionsresistenz [69][101] bis zur Inhibition der Lymphozytenproliferation [121]. Auch viele Zytokine werden über ihn reguliert, z.B. Interferon gamma, Interleukin 2 und 12 [68]. Die Rezeptoren finden sich konstitutiv auf den Immunzellen [12]. CB2- Rezeptoren wurden 1993 geklont [16], weisen ebenfalls sieben Transmembrandomänen auf und bestehen aus 360 Aminosäuren.
Neben den Cannabinoidrezeptoren gehört auch der Vanilloidrezeptor VR1 zum Endocannabinoidsystem [114]. Er wurde 1997 zum ersten Mal nachgewiesen [20]. Es handelt sich um einen nicht-selektiven Ionenkanal, der sich v. a. in sensorischen Neuronen findet, aber auch im ZNS. Seine Funktion besteht in einer intrazellulären Bindungsstelle für Anandamid. Seine Aktivierung kann neben Rezeptorliganden auch durch physikalische Einflüsse wie Hitze oder Säure getriggert werden. Durch die Aktivierung kommt es zu einem Kalziumanstieg in der Zelle [132], einer Glutamat-Ausschüttung [86] und einem substantiellen Beitrag zur neuronalen Exzitotoxizität.
Neben der Beteiligung an Vasorelaxation und Hypotension ist der VR1-Rezeptor in die Regulation der Schmerzempfindung eingebunden [33].
Weitere Untersuchungen, z.B. mit Cannabinoidrezeptoragonisten an CB1-Knock-out-Mäusen, geben Hinweise auf weitere Cannabinoidrezeptoren [18][40], da auch bei diesen Mäusen Cannabinoideffekte hervorgerufen werden konnten [148].
1.2.4 Genetik des Endocannabinoidsystems
Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollen verschiedene Gene des Endocannabinoidsystems untersucht werden. Derzeit bekannt sind die oben beschriebenen Rezeptoren, sowie einige Enzyme, die beim Abbau von Anandamid und 2-AG eine Rolle spielen. Zur Untersuchung der ausgewählten Gene wurden Einzelbasenpaaraustausch-Polymorphismen, so genannte
„single nucleotide polymorphisms“ (SNPs) benutzt. Diese SNPs wurden nach mehreren Parametern ausgewählt. Sie sollten eine möglichst ausgeglichene Heterozygotenfrequenz aufweisen, eine Schnittstelle für ein Restriktionsenzym oder die Möglichkeit, mit Hilfe eines mismatch-Primers eine künstliche Schnittstelle zu schaffen. Es wurden SNPs bevorzugt, die im codierenden Teil des Gens liegen, dabei besonders jene, die zu einer Veränderung in der Aminosäuresequenz des daraus resultierenden Proteins führen.
Da zu Beginn dieser Arbeit nicht für alle Gene SNPs mit bekannten Heterozygotenfrequenzen zur Verfügung standen, wurden auch einige SNPs ohne Kenntnis derselben untersucht. Dabei stellte sich während der Untersuchungen auch heraus, dass manche (angeblichen) SNPs eine Verteilung von 100 % für eine Base hatten und sie somit für eine Auswertung nicht zu gebrauchen waren.
Die folgende Tabelle gibt eine Auskunft über die untersuchten Gene:
Chromosom Gen (NCBI- Bezeichnung)
Untersuchte SNPs Produkt
1p36.11 CNR2 2229579 (C/T) Tyr -> His Cannabinoidrezeptor 2 1p35-p34 FAAH 1053627 (A/C) untranslatiert
324420 (C/A) Thr -> Pro
Fatty acid amino hydrolase
1q25.2-q25.3 PTGS2 2066826 (G/A) Intron Cyclooxygenase 2 3q21.3 MGLL 500104 (G/A) Intron
664910 (A/G) Intron
Monoglycerollipase
6q14-q15 CNR1 1049353 (G/A) Thr -> Thr AL136096 (AAT-Repeat)
Cannabinoidrezeptor 1
17p13.3 TRPV1 733080 (T/C) untranslatiert 224535 (A/G) Intron
Vanilloidrezeptor 1
17p13.3 ALOX15 916055 (T/C) untranslatiert 15-Lipoxygenase 17p13.1 ALOX12 2271316 (G/C) Locus-Region 12-Lipoxygenase
Einleitung 20 Bei dem CNR2-Gen wurde lediglich der oben angegebene SNP vollständig ausgewertet. Es wurden jedoch insgesamt 13 SNPs untersucht, ein Teil davon nur bei den Kontrollen:
2501432 (G/A) 2502992 (G/A)
2501431 (T/C) nur bei Kontrollen 3003336 (A/G)
sequenziert 4649124 (C/T)
2502993 (C/T) (C/T) 2229579
2229580 (A/G) 2229581 (G/C)
bei allen Proben 2229582 (C/G)
2229583 (A/G) untersucht 2229584 (G/A)
2229585 (G/A) 2229586 (G/C)
Dabei stellte sich heraus, dass die CNR2-SNPs in einem Kopplungsungleichgewicht stehen und sich daraus drei Haplotypen ableiten lassen:
CNR2-13-SNP-Haplotyp
1: G-G-T-A-C-C-C-A-G-C-A-G-G-G 2: A-A-C-G-T-T-C-G-C-C-G-A-A-C 3: A-A-C-G-T-T-T-G-C-C-G-A-A-C
Betrachtet man diese drei Haplotypen, so fällt auf, dass sich Haplotyp 2 und 3 lediglich in einer Base unterscheiden. Da der Haplotyp 2 der häufigere ist, lässt sich vermuten, dass der Haplotyp 3 aus Haplotyp 2 mittels einer Punktmutation entstanden ist.
Aus diesen Haplotypen lässt sich auch auf die bei den Patienten-Proben nicht untersuchten SNPs von 2501432-2502993 schließen, so dass auf weitere Sequenzierungen verzichtet werden kann.
1.3 Zusammenhang zwischen Spastik bei MS und dem Endocannabinoidsystem
1.3.1 Grundlagen der Spastik
Der Begriff Spastik ist vom griechischen Wort „spasmos“ abgeleitet und kann mit „Krampf“
übersetzt werden. Es handelt sich dabei um eine geschwindigkeitsabhängige Tonuserhöhung der Skelettmuskulatur während passiver Dehnung, also ohne vorherige Innervation der betreffenden Muskulatur. Bei fortgesetzter Dehnung kann der Muskeltonus plötzlich nachlassen, auch bekannt als Taschenmesserphänomen. Bevorzugt betroffen sind vor allem Muskeln, die der Schwerkraft entgegenwirken. An den Armen überwiegen die Flexoren, an den Beinen die Extensoren. Daneben gibt es typische weitere begleitende Symptome, die jedoch nicht obligat auftreten müssen. Dazu zählen z.B. Paresen oder Verlangsamung von Bewegungen, gesteigerte Muskeleigenreflexe, pathologische Fremdreflexe (Pyramiden- bahnzeichen) und Massenreflexe.
Ursächlich für die Spastik wird eine axonale Schädigung der in der Pyramidenbahn absteigenden α-Motoneurone angesehen. Dabei müssen jedoch auch immer Bahnen des extrapyramidalen Systems geschädigt sein, denn isolierte Störungen der Pyramidenbahn allein bedingen keine Spastik. Mögliche Gründe für eine Schädigung des ersten Motoneurons sind beispielsweise Schädel-Hirn-Traumata oder Querschnittslähmungen, Entzündungen (Meningitis, Encephalitis, aber auch Multiple Sklerose), Durchblutungsstörungen (Hirn- blutungen, Schlaganfälle), Zerebralparesen oder die amyotrophe Lateralsklerose.
Eine Spastik stellt sich jedoch nicht sofort nach dem schädigenden Ereignis, sondern erst im Verlauf von Wochen ein. Die Unterbrechung der Leitungsbahnen ist folglich nicht die eigentliche Ursache, sondern die auf dieses Ereignis folgenden Regenerationsprozesse. Dabei kommt es unter anderem zu einer gesteigerten segmentalen Erregbarkeit der α-Motoneurone und einer damit verbundenen Hyperreflexie. Andererseits treten veränderte kontraktile Eigenschaften der spastischen Muskulatur auf [35], deren Ursache nicht vollständig bekannt ist. Aber auch eine Autonomie spinaler Zentren spielt eine Rolle, da sie nicht mehr der Kontrolle der absteigenden motorischen Bahnen unterstehen.
Therapieoptionen bei Spastik ist neben der Physio- und Ergotherapie sowie der progressiven Muskelrelaxation die medikamentöse Behandlung [1][6]. Als erste Wahl kommen wegen ihrer geringen Nebenwirkungen Baclofen oder Tizanidin in Betracht. Weiterhin indiziert sind Clonazepam, Tetrazepam oder Diazepam. An dritter Stelle stehen Dantrolen, Clonidin oder Memantin. Daneben gibt es auch spezielle Therapieformen wie z.B. die Applikation von
Einleitung 22 Botulinumtoxin oder die intrathekale Gabe von Baclofen. Positive Wirkungen auf Spastik sind auch für Progabide, L-Dopa und Cannabis beschrieben. Dennoch ist eine Spastik in der Regel nicht rückbildungsfähig, da die axonale Schädigung irreversibel ist.
Zur objektiven Messung einer Spastik, ist die modifizierte Ashworth-Skala [15] weit verbreitet. Dabei handelt es sich um eine Ordinalskala zur Messung der Muskelintensität.
Geprüft wird mit passiven Bewegungen der Extremitäten. Dabei werden Hüftgelenk, Kniegelenk und Sprunggelenk auf der paretischen und auf der nicht-betroffenen Seite untersucht und nach folgendem Schema bewertet:
Grad 0 keine Tonuserhöhung
Grad 1 leichter Anstieg des Tonus, der einen „Anschlag“ („Sperre“) gibt, wenn die Extremität in Flexion oder Extension bewegt wird
Grad 2 stärker ausgeprägter Anstieg des Tonus, aber leichte Beugung der Extremität Grad 3 beträchtlicher Anstieg des Tonus – passive Bewegung schwierig
Grad 4 Extremität ist fixiert bei Beugung oder Streckung
1.3.2 Endocannabinoide und Spastik
In einer Vielzahl von Einzelfällen berichten Patienten, dass sie unter Cannabis-Konsum oft eine deutliche Verbesserung ihrer Symptome empfinden [26][96]. In Großbritannien gab es 2003 dazu eine erste große, multizentrische, randomisierte und placebokontrollierte Studie.
Zwar konnte in dieser Studie kein positiver Effekt der Cannabinoid-Behandlung auf die Spastik, gemessen mittels der Ashworth-Skala, nachgewiesen werden, wohl aber eine objektivierbare Verbesserung der Mobilität und eine Verbesserung der Schmerzempfindung in der subjektiven Beurteilung [145]. Auch in der Folgestudie dieser Untersuchung konnten ähnliche Ergebnisse der Therapie mit Cannabinoiden nachgewiesen werden [146]; u. a. war ein positiver, wenn auch begrenzter, Langzeiteffekt auf die subjektiv wahrgenommene Spastizität nach einem Jahr zu beobachten. Ernsthafte Nebenwirkungen gab es dagegen nicht.
Auch 2004 konnten in drei klinischen Studien therapeutische Wirkungen von Cannabis bei Multipler Sklerose nachweisen werden. In einer Schweizer Studie konnte gezeigt werden, dass Cannabis-Extrakte „bei Patienten mit persistierender Spastik, die nicht auf andere Medikamente ansprechen, bei akzeptablen Nebenwirkungen die Spasmusfrequenz verringern und die Mobilität verbessern können“ [136]. In der zweiten Studie [138] konnten die Spastikwerte signifikant reduziert werden. Und die dritte Studie [17] beschreibt den durchweg positiven Einfluss von Cannabis auf Blasenfunktionsstörungen.
Doch auch aus Untersuchungen an Tiermodellen lässt sich eine Beziehung des endocannabinoiden Systems mit der Multiplen Sklerose ableiten.
An einem MS-Mausmodell mit so genannten CREAE-Mäusen [5] konnte gezeigt werden, dass die Spastizität unter dem Einfluss von Endocannabinoiden verbessert werden kann.
Dieses kann sowohl durch die Gabe von Cannabinoiden als auch durch die Inhibition des Abbaus von Endocannabinoiden erreicht werden (s. Abschnitt 1.2.1).
Weiterhin fanden sich Hinweise darauf, dass sich durch Cannabinoidgabe die Neurodegeneration bei dem MS-Mausmodell vermindern lässt [113]. Außerdem zeigte sich bei Cannabinoidrezeptor-(CB1)-defizienten Mäusen eine verminderte Toleranz für inflammatorische und exogen-toxische Schädigungen, die mit einer verstärkten Neurodegeneration einhergehen. Die neuroprotektive Wirkung von Cannabinoiden konnte darüber hinaus an dem so genannten TMEV- (Theiler´s murine encephalomyelitis virus) Modell nachgewiesen werden [3] (s. Abschnitt 1.3.4).
Einleitung 24 1.3.3 Bisherige Untersuchungen
Durch mehrere Doktorarbeiten ist die molekulargenetische Untersuchung von Polymorphismen des zentralen Cannabinoidrezeptor (CNR1) bereits am Institut für Humangenetik der MHH etabliert [42][55]. Der dabei untersuchte SNP 1049353 sowie ein AAT-Repeat wurden auch in diese Doktorarbeit einbezogen, PCR-Bedingungen und der für den SNP notwendige Restriktionsverdau wurden übernommen, die Längenbestimmung der AAT-Allele wurde mit Hilfe des Sequenziergerätes ABI Prism 310 Genetic Analyzer durchgeführt.
Eine andere Untersuchung zum Cannabinoidrezeptor zeigte einen möglichen Zusammenhang zwischen dem oben erwähnten AAT-Repeat und i.v.-Drogenmissbrauch [25]. Des Weiteren konnte eine mögliche Verbindung zur Schizophrenie nachgewiesen werden [134], besonders bei dem hebephrenen Typ. Aber auch bei anderen Gemütsstörungen, z.B. Depression bei Parkinson [6], gibt es einen Zusammenhang mit CNR1-Polymorphismen.
Auch für die Fatty acid amino hydrolase, kurz FAAH, konnte eine Assoziation zwischen dem SNP 324420 und Drogenmissbrauch nachgewiesen werden [124]. Später konnte auch gezeigt werden, dass eine reduzierte Expression und Aktivität dieser P129T-Mutation der FAAH eine Verbindung des Endocannabinoidsystems mit Drogenmissbrauch darstellt [23]. Aber auch für Übergewicht und Fettleibigkeit besteht eine Assoziation mit diesem SNP [125].
Außerdem wurde im Frühjahr 2005 ein SNP im CB2-Gen identifiziert, der möglicherweise mit einem erhöhten Risiko für Autoimmunerkrankungen einhergeht [123]. Ohne das dieses vor Beginn dieser Arbeit bekannt war, wurde der dort angesprochene SNPs rs2501432 (G/A) mit untersucht, da er nahe dem untersuchten SNP 2229579 im codierenden Bereich liegt und zu einer veränderten Aminosäure (Arginin -> Glutamin) führt. Es stellte sich jedoch bei der Untersuchung der Gesundkontrollen heraus, dass dieser SNP im Kopplungsungleichgewicht mit den SNP 2229579-86 steht, so dass auf eine Untersuchung bei den MS-Proben verzichtet wurde und statt dessen die bereits vorher untersuchten SNPs ausgewertet wurden. Dieses gilt auch für den in dem Text angesprochenen, synonym codierenden SNP rs2502992, der ebenfalls bei den Gesundkontrollen in der gleichen Sequenzierung erfasst wurde.
Alle hier erwähnten Polymorphismen wurden in diese Arbeit mit einbezogen.
1.3.4 Modelle und Forschungen an Mausmodellen
Da die Multiple Sklerose bei Tieren nicht vorkommt, wurden einige Virusmodelle an Tieren entwickelt, die der Pathophysiologie und Symptomatik sehr ähneln. Sie dienen als Grundlage in der Erforschung der Multiplen Sklerose, aber auch des Endocannabinoidsystems. Dabei sind vor allem zwei Modelle im Rahmen dieser Arbeit von besonderem Interesse.
Das „chronic relapsing experimental allergic/autoimmune encephalomyelitis“-(CREAE)- Modell zeigt bei Mäusen eine T-Zell-vermittelte Demyelinisierung und einen axonalen Verlust von Nervenfasern, welcher in einem der MS ähnlichen Krankheitsbild mündet. Es kann dabei je nach Experimentierbedingungen ein akuter oder ein chronisch-rückfallender Verlauf induziert werden. Dabei zeigen sich auch Symptome wie Spastizität, die auch für die MS typisch sind [4]. In diesem Mausmodell konnte auch gezeigt werden, dass Cannabinoidrezeptor-Antagonisten eine Spastik vorübergehend verschlimmern können.
Spastizität wird also (mit-)bestimmt durch das Gleichgewicht des Endocannabinoidsystems.
Außerdem konnten erhöhte Werte von AEA, 2-AG und dem AEA verwandten Palmitylethanolamid (PEA) in ZNS-Regionen nachgewiesen werden, die mit Nervenschäden assoziiert waren, nicht dagegen bei normalen oder nicht-spastischen CREAE-Mäusen. Auch exogen zugeführte Endocannabinoide verbesserten die Spastik signifikant, Inhibitoren der AEA-Hydrolyse dagegen führten zu einer Verschlechterung.
Zum anderen ist das TMEV-Modell von besonderer Bedeutung. Bei dem „Theiler’s murine encephalomyelitis virus“ handelt es sich um ein Picorna-Virus-Modell mit MS-ähnlicher Demyelinisierung. Es ist von Natur aus pathogen bei Mäusen. Injiziert man es in empfängliche Zellen, induziert es einen chronisch progressiven und demyelinisierenden Prozess, der einer MS sehr ähnelt [29]. Es kommt zu einer Immunantwort gegen virale Epitope und auch gegen Myelin [98], welche für die Demyelinisierung verantwortlich gemacht wird. Klinisch zeigen diese Mäuse die typischen neurologischen Ausfälle, inklusive der Beeinträchtigung der motorischen Koordination, Inkontinenz und Lähmungen, die mit dem Verlust von Axonen und elektrophysiologischen Veränderungen assoziiert sind [93]. In einem TMEV-Mausmodell konnte gezeigt werden, dass die Behandlung mit synthetischen Cannabinoiden (WIN 55,212-2, JWH-015) zu einer deutlichen Verbesserung neurologischer Defizite führt [3].
Einleitung 26 1.4 Zielsetzung dieser Doktorarbeit
Mittels einer Fall-Kontroll-Studie soll festgestellt werden, ob verschiedene genetische Polymorphismen von bestimmten Kandidatengenen des endocannabinoiden Systems eine Assoziation zu unterschiedlichen MS-Phänotypen aufweisen.
Hierzu wurde im Vorfeld des experimentellen Teils dieser Doktorarbeit eine umfangreiche Datenbankrecherche zur Identifizierung weiterer Polymorphismen durchgeführt, die innerhalb oder eng benachbart zu Genen liegen, die für bewiesene oder wahrscheinliche Komponenten des Endocannabinoidsystems kodieren. Einerseits handelt es sich hierbei um Gene, die für Rezeptoren von Endocannabinoiden kodieren (CNR1, CNR2, TRPV1), andererseits um Gene, die für Enzyme kodieren, die beim Abbau endogener Cannabinoide eine Rolle spielen (FAAH, ALOX12, ALOX15, PTGS2 & MGLL).
1.5 Assoziationsstudien
Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen entsprechen dem Prinzip einer Assoziationsstudie. Genetische Assoziationsstudien spielen eine zunehmende Rolle bei der Erforschung genetischer Risikofaktoren von verschiedenen Erkrankungen. Durch Vergleich einer Patientenstichprobe mit einer Kontrollgruppe gesunder Personen ist es möglich, ein mit der Erkrankung verknüpftes genetisches Merkmal, also eine Veränderung in der DNA- Sequenz, zu finden. Durch Assoziationsstudien wird also versucht, Krankheitsgene auf dem Genom zu lokalisieren. Die Lokalisation beruht auf der Detektion von Krankheitsassoziation mit bestimmten „single nukleotide polymorphism“, kurz SNP. Assoziationsstudien bieten für die genetische Dissektion komplexer Erkrankungen praktische Vorteile, denn sie sind insbesondere für die Aufdeckung von Risikogenen mit kleinem bis moderatem relativem Risiko für einen komplexen Endpunkt statistisch effizienter als die Kopplungsanalyse [115].
Zudem können in der Auswahl der Kandidatengene bereits bekannte biologische Mechanismen für die Erkrankung berücksichtigt werden.
Bei diesem Studientyp handelt es sich um eine retrospektive Studie. Für die statistische Auswertung bedeutet diese Tatsache, dass eine Angabe relativer Risiken aufgrund der fehlenden Inzidenz nicht möglich ist. Daher berechnet man hier die Odds ratio, welches eine gute Annäherung an das relative Risiko ermöglicht (s. Abschnitt 3.7).
Dennoch findet sich derzeit eine Vielzahl genetischer Assoziationsstudien mit widersprüchlichen Ergebnissen. Die folgende Tabelle gibt Auskunft über mögliche Ursachen für diskrepante Studienergebnisse genetischer Assoziationsstudien:
Zufallsfehler - Zufallsbefund durch multiples Testen - Studiengröße zu gering
- Falsche Auswahl der genetischen Variante - Genotypisierungsfehler
Confounding und Bias - Phänotyp wird durch verschiedene Allele in unterschiedlichen Genen beeinflusst (Allelische Heterogenität)
- Phänotyp kann durch verschiedene pathophysiologische Mecha- nismen hervorgerufen werden (Ätiologische Heterogenität) - Unterschiedliche ethnische Zusammensetzung der Studien- population in Multizentrischen Studien
- Studienpopulation besteht aus verschiedenen Untergruppen mit unterschiedlichen Allelfrequenzen (Populationsstratifikation) - Missklassifikation der Erkrankung oder Komplikation
- Zugrunde liegende Haplotypen nicht berücksichtigt - Mischung aus inzidenten und prävalenten Fällen Interaktion und
Effektmodifizierung
- Nicht identifizierte Gen-Gen-Interaktionen - Nicht identifizierte Gen-Umwelt-Interaktionen - Nicht identifizierte Gen-Lifestyle-Interaktionen
Eine spätere Replikation der Studienergebnisse erweist sich in einer Analyse als wahrscheinlich, wenn zwei Studien die Assoziation mit P<0,01 oder eine einzelne Studie diese mit P<0,001 nachgewiesen haben [79].
Material und Methoden 28 2 Materialen und Geräte
2.1 Verwendete Chemikalien
2.1.1 Allgemeine Chemikalien
Agarose Gibco BRL, Eggenstein
Bayol F Mineralöl Serva, Feinbiochemika, Heidelberg Ethidiumbromid (1 mg/ml) Sigma Chemie, Diedenhofen
Formaldehyd (37 %) Merck, Darmstadt
Glycerin (87 %) Merck, Darmstadt
NuSieve-Agarose Difco Laboratories, Detroit (USA)
Seakem-Agarose Biozym, Hessisch Oldendorf
2.1.2 Enzyme und biologische Substanzen
Desoxyribonukleosidtriphosphate Boehringer, Mannheim Biochemika Oligonukleotide als Primer für
PCR
MWG Biotech AG, Ebersberg Restriktionsenzyme und Puffer,
BSA
New England Biolabs, Schwalbach
Taq-DNA-Polymerase, Puffer und Q-Solution
Qiagen, Hilden
DNA-Marker 1 kb-Leiter Gibco-BRL, Eggenstein Tamra - RFLP-Längenstandard
1:100 Verdünnung mit Formamid
Applied Biosystems, Weiterstadt
Exo SAP-IT Amershan Biosciences, Freiburg
Sephadex Sigma Aldrich Chemie, Steinheim
2.1.3 Kits
GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit
Amershan Biosciences, Freiburg
DNA-Sequencing kit-Dye- Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Big dye 1.1)
Princeton separations
Dye ExTM 2.0 Spin Kit Qiagen, Hilden
Material und Methoden 30 2.1.4 Standardlösungen, Standardmedien und Puffer
10x TBE-Laufpuffer 0,9 M Tris-Hcl 540 g 0,9 M Borsäure (H3BO3) 275 g 0,02 M EDTA 37,2 g + 5 l destilliertes H2O,
auf pH 8,3 einstellen Auftragspuffer für
Gelelektrophorese
7,5 g Ficoll 10 mM EDTA
0,1 % Bromphenolblau 0,1 % Xylencyanoblau
Auffüllen auf 50 ml mit destilliertem H2O
Ansatz für 2-%iges Agarosegel Für 100 ml:
100 ml TBE-Puffer 2 g Agarose
-> 3 Minuten in Mikrowelle bei 1200 Watt, dann Abkühlen lassen, Zugabe von 40 µl Ethidiumbromid, in Gelkammer gießen
Ansatz für 4 %iges NuSieve- Seakamgel
100 ml TBE-Puffer
3 g NuSieve-Agarose 1g Seakam-Agarose
-> 8 Minuten in Mikrowelle bei 600 Watt, dann Abkühlen lassen, Zugabe von 60 µl Ethidiumbromid, in Gelkammer gießen
2.2 Materialen und Geräte
2.2.1 Geräte & Filme
Autoklav Jürgens, Hannover
Brutschränke Heraeus Instruments, Hanau
Elektrophorese-Geräte Horizon 11.14, Bethesda Research Laboratories, Life Technologies Inc.
Eismaschine Ziegra
Geldokumentation:
- Bioprofil-Videosystem - Video copy processor
- Thermal paper film Model K 65 HM
- UV-Transilluminator
Vilber Lourmat, über Fröbel, Lindau Mitsubishi (Japan)
Mitsubishi (Japan) Bachofer
Heizblock Eppendorf, Hamburg
Mikrowelle Sharp
Photometer Lambda 2 Perkin Elmer, Weiterstadt Pipetten, einstellbar Eppendorf, Hamburg Sequenziergeräte:
- ABI Prism 310 Gen. Analyzer - ABI Prism 3100-Avant Genetic Analyzer
Perkin Elmer, Weiterstadt Perkin Elmer, Weiterstadt Spannungsgerät für
Elektrophorese Power Pack 0-250 V
Biometra, Göttingen
Temperaturprozessoren - MHH-Eigenbau (PCR, Denaturierung)
- Eppendorf (PCR)
- Biometra (PCR, Sequen- zierungsreaktionen)
- Gene AMP PCR System 9600 (Exo SAP-IT-Reaktion)
Landgraf, Hannover Eppendorf, Hamburg Biometra, Göttingen
Applied Biosystems, Weiterstadt
Vortex Genie-Mixer Janke & Funkel
Material und Methoden 32
Waage Sartorius, Göttingen
Zentrifugen Biofuge 13, Heraeus Instruments,
Hanau
Mini Centrifuge, National Lab Co, Wood-bridge
Zentrifuge 3200, Eppendorf, Hamburg Mini spin, Eppendorf, Hamburg Centrifuge 5810 R, Eppendorf, Hamburg
2.2.2 Kleinmaterialien
Einmalhandschuhe Safeskin Corp., San Diego (USA)
Eppendorfspitzen Eppendorf, Hamburg
Sarstedt, Nürnbrecht
Parafilm American National Can, Greenwich
Reaktionsgefäße Eppendorf, Hamburg
Sarstedt, Nürnbrecht
Biozym, Hessisch Oldendorf MultiScreen ® HTS,HV Platten Millipore, Molsheim
2.3 Das Patienten- und das Kontrollkollektiv
Die DNA-Proben der Multiple-Sklerose-Patienten wurden freundlicherweise von Frau Prof.
Dr. med. Cornelia Hardt (Universität Essen) zur Verfügung gestellt. Es handelt sich dabei um Patienten aus der Multicenter-Studie in Deutschland. Alle Patienten hatten eine RRMS (Relapsing-Remitting Multiple Sklerose), also eine MS mit schubförmigem Verlauf und waren zwischen 19 und 53 Jahre alt. Aufgeteilt waren diese Proben auf 2 Gruppen, einmal MS-Patienten mit Spastik als Symptom, die zweite Gruppe dagegen bestand aus DNA-Proben von MS-Patienten ohne Spastik als Symptom.
Insgesamt standen also 82 DNA-Proben von Patienten zur Verfügung. Die erste Gruppe wurde von MS 1 bis MS 41 (MS für Multiple Sklerose) nummeriert und beinhaltet die DNA- Proben der Patienten mit Spastik, die zweite Gruppe wurde von MS 43 bis MS 84 nummeriert (es gab keine Proben mit der Nummer 42 und 51) und beinhaltete die Proben der MS-
Patienten ohne Spastik. Die Zuordnung der Patienten zu den Gruppen erfolgte nach pharmakologischen Gesichtspunkten. Patienten die einer Therapie von spastischen Symptomen (entweder mit Baclofen oder mit Tizanidin) bedurften, wurden der ersten Gruppe zugeordnet. Hatten die Patienten zwar eine nachgewiesene MS, aber keine Spastik-spezifische Therapie, wurden sie der zweiten Gruppe zugeteilt. Alle Patienten wurden mit Interferon beta behandelt.
Die folgende Tabelle gibt eine Übersicht über das Patientenkollektiv (CO = Control, Patienten ohne spastik-spezifische Therapie):
Nr. Therapie Alter (Jahre)
Geschlecht EDS- Skala
Nr. Therapie Alter (Jahre)
Geschlecht EDS- Skala
1 Baclofen 33 W 2 43 CO 27 W 4,5
2 Baclofen 35 M 3,5 44 CO 46 M 2,5
3 Baclofen 28 M 3,5 45 CO 36 M 3,5
4 Baclofen 47 M 3,5 46 CO 32 W 1
5 Tizanidin 45 M 4,5 47 CO 39 W 4,5
6 Baclofen 36 W 5,5 48 CO 26 W 3
7 Baclofen 37 W 3 49 CO 45 W 2
8 Baclofen 46 W 3,5 50 CO 41 W 3,5
9 Baclofen 47 W 5,5 52 CO 45 W 3,5
10 Baclofen 40 M 3,5 53 CO 42 W 5
11 Tizanidin 44 M 2 54 CO 47 W 4
12 Baclofen 32 W 1 55 CO 38 W 3,5
13 Baclofen 37 M 1,5 56 CO 42 M 3,5
14 Baclofen 27 W 4 57 CO 35 W 1,5
15 Baclofen 36 M 5,5 58 CO 43 W 3,5
16 Baclofen 43 W 3,5 59 CO 38 M 2
17 Baclofen 37 M 4 60 CO 34 W 3,5
18 Baclofen 35 W 1,5 61 CO 37 M 4
19 Baclofen 20 W 3,5 62 CO 32 W 1,5
20 Baclofen 39 W 5,5 63 CO 29 W 3,5
21 Baclofen 45 W 3,5 64 CO 43 W 3,5
22 Baclofen 50 W 3,5 65 CO 36 M 4,5
23 Baclofen 52 W 5,5 66 CO 49 W 3,5
24 Tizanidin 28 M 4 67 CO 52 W 4
25 Baclofen 53 M 3 68 CO 30 W 2
26 Tizanidin 42 W 3,5 69 CO 39 M 3,5
27 Tizanidin 39 M 3,5 70 CO 45 W 3,5
28 Baclofen 42 W 5 71 CO 29 M 3
29 Tizanidin 34 W 3,5 72 CO 34 M 5
30 Tizanidin 40 M 3 73 CO 28 M 4
31 Baclofen 29 W 4 74 CO 39 M 3,5
32 Baclofen 36 M 5 75 CO 46 M 3,5
33 Baclofen 39 W 4 76 CO 44 M 3,5
34 Baclofen 55 W 4 77 CO 52 W 5,5
35 Baclofen 26 W 3 78 CO 19 W 3,5
36 Baclofen 39 W 3,5 79 CO 36 W 4,5
37 Baclofen 30 W 2 80 CO 36 W 3,5
38 Baclofen 43 W 3,5 81 CO 47 W 5
39 Tizanidin 44 W 2 82 CO 39 W 5,5
40 Baclofen 46 W 3,5 83 CO 53 M 3
41 Baclofen 33 M 3,5 84 CO 27 M 5
Material und Methoden 34 Für die beiden MS-Gruppen ergeben sich folgende Mittelwerte:
Alter in Jahren EDSS Verhältnis M:W
MS mit Spastik 38,8 3,56 15:26
MS ohne Spastik 38,5 3,56 15:26
Mit Hilfe der EDS-Skala (EDSS steht für Expandet Disability Status Scale) wird der Grad der Behinderung bei MS-Patienten gemessen, sie wurde modifiziert (Patienten, bei denen das zerebrale Funktionssystem mit '1' bewertet wurde und die restlichen Systeme als unauffällig '0' eingestuft wurden, wurden entsprechend der englischen Version der EDS-Skala als 0 gewertet). Die Bedeutung des Zahlenwertes entspricht bei:
0,0 Keinerlei Einschränkungen
1,0 Keine Behinderungen, jedoch minimale Abweichungen in einem funktionellen System
1,5 Keine Behinderungen, jedoch minimale Abweichungen in mehr als einem funktionellen System 2,0 Minimale Einschränkungen in einem funktionellen System
2,5 Minimale Einschränkungen in zwei funktionellen Systemen
3,0 Noch voll gehfähig, jedoch leichte Einschränkungen in 3 oder 4 funktionellen Systemen 3,5 Noch voll gehfähig, jedoch leichte Einschränkungen in einem funktionellen System Grad 2 4,0 Schwere Behinderung, aber noch 500 Meter ohne Pause und Hilfe gehfähig
4,5 Schwere Behinderung, aber noch mindestens 300 Meter mit leichter Hilfe gehfähig 5,0 200 Meter gehfähig ohne Hilfe und Pause, Alltagsleben stark eingeschränkt
5,5 100 Meter ohne Hilfe und Pause gehfähig, Alltagsleben nicht mehr alleine zu erledigen 6,0 Mit einseitiger Gehhilfe ohne Rast 100 Meter gehfähig
6,5 Beidseitige Gehhilfen um 20 Meter ohne Pause zu bewältigen
7,0 Gehstrecke mit Hilfe unter 5 Meter, zu 99% den Rollstuhl selbst bewegend
7,5 Rollstuhlgebunden, nur noch ein paar Schritte gehfähig, kann nicht den ganzen Tag im Rollstuhl verbringen
8,0 Rollstuhl oder ans Bett gebunden, kann Rollstuhl noch selbst bewegen 8,5 Hauptsächlich ans Bett gebunden, Selbstpflege nur noch wenig möglich 9,0 Ganztägig bettlägerig, kann sprechen und essen
9,5 Hilflos, kann weder sprechen noch schlucken oder essen 10,0 Tod durch Multiple Sklerose
Um die Ergebnisse der Patientenkollektive verifizieren zu können, wurde ein drittes Kollektiv von 50 DNA-Proben gesunder Kontrollprobanden gebildet.
