3.2.1 PCR mit DNA
Die Polymerase-Kettenreaktion, kurz PCR (polymerase chain reaction) ermöglicht die in vitro-Amplifizierung spezifischer DNA-Sequenzen. Innerhalb von etwa zwei Stunden kann man mit ihrer Hilfe bis zu zwei Millionen Kopien einer Vorlagensequenz (so genanntes template) zu erzeugen.
Dieses 1986 von Mullis et al. [103] vorgestellte Verfahren basiert auf einer enzymatischen Vermehrung eines DNA-Abschnittes zwischen zwei Oligonukleotid-Primern (s.u.), die gegenläufig an komplementäre Stränge der DNA gebunden sind. Dadurch wird die Amplifizierung des gewünschten DNA-Abschnittes ermöglicht.
Das Verfahren beruht auf den Eigenschaften Polymerase, der Taq-Polymerase, die von dem Wärme liebenden, vulkanische Gewässer besiedelnden Thermophilus aquaticus-Bakterien isoliert werden kann. Das Temperaturoptimum dieses Enzyms liegt bei ca. 72 °C und hat eine Stabilität bis nahezu 100 °C. Diese hohe Temperaturstabilität ermöglichte den effektiven Einsatz und machte erstmals eine Automatisierung der PCR möglich. Im Gegensatz zu den früher genutzten, thermolabileren DNA-Polymerasen wie z.B. dem Klenow-Fragment der E.
coli-DNA-Polymerase I, kann die Taq-Polymerase bereits vor Beginn der PCR dem Ansatz hinzugefügt werden.
Die exponentielle Vervielfältigung wird bei der PCR durch ein zyklisches Temperaturprofil erreicht. Doch als erstes erfolgt eine fünf- bis siebenminütige (bei Zugabe von Q-Solution erhöht sich diese Zeit auf zwölf Minuten) Denaturierung bei 96 °C, wobei aus der template-DNA komplementäre Einzelstränge entstehen. Mit Hilfe der Taq-Polymerase erfolgt nun eine Duplikation der Einzelstrang-Vorlage. Hierzu benötigt sie die in dem Reaktionsansatz enthaltenen Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs). Als Startpunkt der Neusynthese dient ein
kurzer, zum Mutterstrang komplementärer Abschnitt, der ein freies 3´-OH-Ende zur Anknüpfung der dNTPs besitzen muss. Diese so genannten Primer, kurze Oligonukleotide von ca. zwanzig Basen (mindestens jedoch 18, um spezifisch zu binden), werden so ausgewählt, dass sie die Zielsequenz großzügig einrahmen. Da sie sich jedoch erst bei Temperaturen anlagern, die unterhalb der Denaturierungsgrenze liegen, folgt dem Denaturierungsschritt ein Anlagerungsschritt, der als Annealing bezeichnet wird.
Annealing-Temperaturen sind für jedes Primer-Paar unterschiedlich und müssen vor der ersten Anwendung durch eine Optimierung bestimmt werden, d. h., es erfolgen Amplifizierungen bei verschiedenen Annealing-Temperaturen. Die optimale Temperatur liegt meist zwischen 48 und 65 °C, die Annealing-Zeit beträgt zwischen 30 Sekunden bis 2 Minuten.
Bei 72 °C schließt sich die Phase der Elongation an, die ebenfalls zwischen 30 Sekunden bis 2 Minuten angesetzt wird. Er wird umso länger gewählt, je länger der zu amplifizierende Abschnitt ist. Nach dem Abschluss der Elongation ist ein Zyklus abgeschlossen und es beginnt erneut ein Denaturierungsprozess. Der Zyklus wird in der Regel 20- bis 40-mal wiederholt.
Nach der dritten Wiederholung wird hauptsächlich das gewünschte Teilstück der DNA als template vermehrt.
Abschließend, nachdem alle Zyklen durchlaufen sind, erfolgt eine zehnminütige Phase der Elongation, die es der Taq-Polymerase erlauben, alle bis dahin unvollständig duplizierten Stränge zu vervollständigen.
Die exakte Dauer der einzelnen Zyklusphasen sowie die Konzentrationen der einzelnen Komponenten sind von der Art des verwendeten templates und den Primern abhängig.
Um Siedeverzüge und Verdampfen der Lösungen in den Reaktionsgefäßen aufgrund der hohen Temperaturen zu vermeiden, werden die Reaktionsansätze für den MHH-Eigenbau-Temperaturprozessor mit Mineralöl (Bayol F) überschichtet. Für die Geräte der Firmen Eppendorf und Biometra ist das nicht notwendig, da sie über Deckelheizungen verfügen.
Diese werden stets mit einer Temperatur von 100 °C betrieben, so dass durch die stets höhere Temperatur von oben ein Siedeverzug verhindert wird. Nach Beendigung der PCR ist es wichtig, dass die amplifizierte DNA kühl aufbewahrt wird, in der Regel durch Programmierung eines abschließenden Kühlzyklus.
Da die PCR geringste Mengen DNA als template benutzen kann, ist es unabdingbar, Verunreinigungen zu vermeiden. Dazu gehört neben autoklavierten Agenzien und
Material und Methoden 40 Werkzeugen auch das saubere Arbeiten und Pipettieren. Ebenso empfiehlt sich das Mitführen eines Leerwertes als Kontrolle.
Beim Pipettieren des Reaktionsansatzes wird die Taq-Polymerase als letztes zugegeben, da sie einerseits temperatur- und andererseits magnesiumempfindlich ist. Um irreversiblen Inaktivierungen des Enzyms durch z.B. zu hohe Mg2+-Konzentrationen vorzubeugen, erfolgt die Zugabe erst zu dem kompletten Reaktionsansatz.
Da im Verlauf dieser Doktorarbeit bei einer PCR häufig der gleiche DNA-Abschnitt bei mehreren Patienten amplifiziert wurde, konnte mit einem so genannten Master-Mix gearbeitet werden. In diesem wird die benötigte Menge an Wasser, Puffer inklusive MgCl2, dNTPs, forward- & reverse-Primern und Taq-Polymerase zusammengegeben, vermischt und gleichmäßig auf die vorgelegte DNA, bzw. das vorgelegte Wasser für die Leerwerte, verteilt.
Dadurch muss insgesamt weniger pipettiert werden, als Folge daraus resultieren weniger Kontaminationen.
3.2.2 Verwendete PCR-Ansätze und Programme
Es wurden (mit einer Ausnahme, s.u.) 50 µl-Ansätze verwendet:
Menge pro Probe (µl) Ausgangskonzentration Konzentration im Ansatz
Aqua 31,8 µl - -
Puffer 5,0 µl 10 x 1x
dNTPs 5,0 µl 2 mM 200 µM
Forward-Primer 3,0 µl 10 µM 0,6 µM
Reverse-Primer 3,0 µl 10 µM 0,6 µM
Taq-Polymerase 0,2 µl 5 U/µl 0,02 U/µl
DNA 2,0 µl 50 ng/µl 2 ng/µl
Lediglich für die aus der Arbeit von D. Gadzicki [42] übernommene PCR für den AAT-Repeat in der Nukleotidsequenz AL136096 im CNR1-Gen wurden die dort angegebenen Mengen übernommen, also 8,9 µl H2O, je 2 µl Puffer und dNTPs, je 1 µl Foward- und Reverse-Primer, 0,1 µl Taq-Polymerase sowie 5 µl DNA. Dieser Ansatz hatte also nur ein Endvolumen von 20 µl.
3.2.3 Auflistung verwendeter Primer
Die PCR für den AAT-Repeat (Nukleotidsequenz AL136096) erfolgte mit einem fluoreszenzgekoppelten Primer, um die Restriktionsfragmentlängen-Analyse im ABI durchführen zu können (siehe Abschnitt 3.6).
Material und Methoden 42 Da bei den SNPs 1049353, 5275 und 20426 in den untersuchten Regionen keine natürlichen Restriktionsschnittstellen vorhanden sind, wurden mit der Hilfe von mismatch-Primern künstliche Schnittstellen geschaffen. Diese mismatch-Primer sind in ihrem 3’-Bereich nicht exakt komplementär zur template-DNA, sondern unterscheiden sich in einer Nukleotid-Position, so dass sich in dem resultierenden PCR-Produkt eine künstliche Schnittstelle ergibt.
Um den SNP auswerten zu können, muss die neu geschaffene Schnittstelle die Position der ausgetauschten Base sowie den zu untersuchenden SNP umfassen. Die Schnittstelle darf in Bezug auf den SNP nur bei einem der möglichen Polymorphismen zustande kommen.
Der folgenden Tabelle sind die so geschaffenen Schnittstellen zu entnehmen:
SNP & Enzym 1049353 (G/A) - Msp I 5275 (T/C) - Hae III 20426 (G/A) - Nla III Stammsequenz 5’-…AGCACGG…-3’ 5’-...-TGGTTAT…-3’ 5’…-GCGATGC…-3’
Mismatch-Primer 5’-…AGCCC-3’ 5’-…TGGC 5’…-G CCA T
Mit Schnittstelle 5’-…AGCCCGG…-3’ 5’-…TGGCCAT…-3’ 5’…-GCCATGC…-3’
Ohne Schnittstelle 5’-…AGCCCAG…-3’ 5’-…TGGCTAT…-3’ 5’…-GCCATAC…-3’
Die abweichende Base ist unterstrichen dargestellt, der SNP-Polymorphismus fett gedruckt.
Bei SNP 1049353 erfolgte ein Austausch von A->C, bei SNP 5275 von T->C und bei SNP 20426 von G->C. Die Erkennungssequenz des Restriktionsenzyms ist in grau unterlegt.
Da die PCR für den SNP 5275 (mit mismatch-Primer) nicht zuverlässig etabliert werden konnte, wurde auf die weitere Untersuchung des SNP verzichtet.
Bei den SNPs 2501432 und 1953538 zeigte sich, dass diese im Kopplungsungleichgewicht mit anderen untersuchten SNPs standen, daher wurden sie nur bei den Kontrollen untersucht, jedoch nicht mehr bei den MS-Proben.
Weiterhin stellte sich heraus, dass bei den SNPs 20426 und 4987009 die unter NCBI angegebenen Heterozygotenfrequenzen nicht zutrafen, es fand sich an diesen Stellen kein SNP, da alle Kontrollproben ausnahmslos eine Restriktionsschnittstelle zeigten. Da folglich alle Proben erfolgreich verdaut wurden, kann ein Fehler im Restriktionsverdau ausgeschlossen werden.