Visuelle Reizung

Mit einer Handlampe wurde zunächst das rezeptive Feld der abgeleiteten Neurone ermittelt. Dann wurde über einen Diaprojektor und ein galvanometergesteuertes Doppelspiegelsystem ein visueller Reiz auf den Schirm projiziert. Der Reiz wurde vor Beginn der Datenaufzeichnung in Form (Punkt oder Balken), Größe und Ausrichtung (horizontal, vertikal oder diagonal) angepasst, so dass jeweils der für die abgeleiteten Neurone optimale Reiz verwendet wurde. Die Präsentation erfolgte als Hin- und Herbewegung, zwischen den Richtungswechseln fand keine Pause in der Stimuluspräsentation statt. Die Reizgeschwindigkeit wurde bei den einzelnen

Messungen variiert, sie lag zwischen 2,5 und 98,3°/s, wobei fünf verschiedene Geschwindigkeitsstufen – abhängig von der absoluten Entfernung des Tieres vom Projektionsschirm und von der zurückgelegten Strecke des Reizes auf dem Schirm – gewählt wurden. Die Neurone wurden zumeist bei drei bis vier verschiedenen Geschwindigkeiten gemessen (= ein Messblock), pro Datei wurden zwischen acht und dreißig Reizdurchläufe (runs) aufgezeichnet.

Sowohl die Zellen des SC, als auch die corticalen Neurone bevorzugten unterschiedliche Reizgeschwindigkeiten. Erfolgte die Präsentation des Reizes bei dieser Vorzugsgeschwindigkeit, so war eine höhere Aktivität [spikes/s] messbar als bei Reizpräsentation mit höheren oder niedrigeren Geschwindigkeiten.

Bei der späteren Datenauswertung wurde nur die optimale Geschwindigkeit berücksichtigt: also diejenige Geschwindigkeit, bei der die maximale Zellaktivität verzeichnet wurde.

Weiterhin wurde die Spontanaktivität aufgezeichnet, bei der die Augen des Tieres mit schwarzen Papierklappen abgedeckt wurden.

3.2.3 Fentanyl

Nach Isolierung einer Einzelzelle (single unit) oder einer Einheit von zwei bis drei Zellen (multi unit) und Optimierung der visuellen Reizung konnte mit der Aufzeichnung der neuronalen Aktivität begonnen werden.

Nachdem ein bis drei Messblöcke komplett aufgenommen waren, wurde Fentanyl als Bolus intravenös in den Dosierungen 3, 5 oder 10 µg/kg KM verabreicht und dieselbe single oder multi unit weiter aufgezeichnet. Es wurde versucht, die abgeleitete Einheit über mindestens 90 Minuten zu halten. Aufgrund der Pharmakokinetik des Präparates wurden die Fentanyl-Injektionen mit zeitlichen Abständen von ca. 120 Minuten vorgenommen. Ein anderer Ansatz bestand in der Kombination eines Fentanyl-Bolus mit anschließender Verabreichung der entsprechenden Menge Fentanyl über die Infusion: 3, 5 oder 10 µg/kg KM pro Stunde.

Tabelle III.2a-d gibt einen Überblick über die durchgeführten Versuche bei jedem Tier. Der Abstand zwischen zwei Versuchstagen betrug mindestens zwei Wochen.

Tab. III.2a-d: Gesamtübersicht über Ziel der durchgeführten Narkosen, Ort der Ableitung und Dosierung von Fentanyl bei Verabreichung als Bolus oder Infusion. 2a:

Tier 2095, 2b: Tier 2099, 2c: Tier 3044 und 2d: Tier 3056.

(h = Stunde; kg = Kilogramm; µg = Mikrogramm; SC = Colliculus superior).

Tab. III.2a: Tier 2095

Verabreichung von Fentanyl

Narkose-Nummer Ziel Ableitort

Bolus Infusion Tab. III.2b: Tier 2099

Verabreichung von Fentanyl

Narkose-Nr. Ziel Ableitort

Bolus Infusion

Tab. III.2c: Tier 3044

Verabreichung von Fentanyl

Narkose-Nr. Ziel Ableitort

Bolus Infusion Tab. III.2d: Tier 3056

Verabreichung von Fentanyl

Narkose-Nr. Ziel Ableitort

Bolus Infusion

3.2.4 Datenaufnahme

Das abgeleitete Signal wurde verstärkt und gefiltert und zu einem Fenster-diskriminator geleitet. An diesem wurde die obere und untere Schwelle des Potentialfensters festgelegt, innerhalb dessen die Signale als Aktionspotentiale diskriminiert und über ein Interface einem PC übermittelt wurden. Über einen Phasenfunktionsgenerator wurden der Beginn der visuellen Reizung und der Startpunkt der Aufzeichnung gekoppelt. Die Aktionspotentiale wurden online auf dem PC-Monitor als Peri-Stimulus-Time-Histogram (PSTH) (Abb. III.2) dargestellt und am Ende der Aufnahme als Datei gespeichert. Die verwendete Software „spisa3“ wurde von Herrn Dr. G. Dörrscheidt und Frau P. Knipschild am Lehrstuhl für Allgemeine Zoologie und Neurobiologie entwickelt. Das PSTH einer Aufnahme beinhaltete die Zellaktivität mehrerer Durchläufe, wobei ein Durchlauf die Aktivität zum jeweiligen Zeitpunkt während der Hin- und der Gegenrichtung hintereinander zeigt. Die Anzahl der aufgezeichneten Durchläufe war variabel und wurde vor Aufzeichnungsbeginn über den Rechner eingegeben.

Die Signale wurden zusätzlich über einen Audioverstärker und zwei Lautsprecher während der Ableitungen hörbar gemacht.

Während der elektrophysiologischen Messungen wurde mit Halothankonzentrationen im Bereich von 0,4 bis 1,0 Vol.-% gearbeitet. Es wurde jeweils diejenige Konzentration beibehalten, die zu Beginn der Messungen bereits über mindestens zwanzig Minuten verabreicht wurde.

Abb. III.2: Darstellung und Erläuterung der aufgezeichneten Zellantwort als Rasterplot (A) und Peri-Stimulus-Time-Histogram = PSTH (B). (bin = Binbreite in Millisekunden; max. Freq. = maximale Frequenz; ms = Millisekunde; pps = pulse per second; s, Sec = Sekunde)

3.2.5 Datenauswertung

Die Verarbeitung der mit „spisa3“ aufgezeichneten Daten erfolgte mit „spical“

(geschrieben von Frau Petra Knipschild, Lehrstuhl für Allgemeine Zoologie und Neurobiologie).

Aus den aufgezeichneten Histogrammen wurde jeweils die mittlere Entladungsrate innerhalb und außerhalb des rezeptiven Feldes ermittelt. Diese Werte wurden dann mit verschiedenen Parametern wie Reizgeschwindigkeit und Zeit vor und nach Fentanyl-Gabe in Beziehung gesetzt.

Als reizgetriebene Aktivität wurde die mittlere Spikerate innerhalb des rezeptiven Feldes abzüglich der reizunabhängigen Aktivität außerhalb des rezeptiven Feldes definiert (siehe Abb. III.2).

Die Spontanaktivität war die mittlere Entladungsrate eines Aufzeichnungszeitraumes, während dessen die Augen des Tieres abgedeckt waren. Im PSTH wurde somit nur basale neuronale Aktivität registriert.

Die Auswertung der Datensätze wurde jeweils auf die Fentanyl-Applikation bezogen.

Ob während der extrazellulären Ableitung einer single oder multi unit mehr als einmal Fentanyl verabreicht wurde, blieb unberücksichtigt.

Die optimale Reizgeschwindigkeit wurde bei der Auswertung der Datensätze anhand der Mediane der Aktivitäten der abgeleiteten units bei verschiedenen Reizgeschwindigkeiten ermittelt. Die Reizgeschwindigkeit mit dem höchsten Aktivitätsmedian wurde als Vorzugsgeschwindigkeit gewertet.

Um zu überprüfen, ob die Verabreichung von Fentanyl sich auf die Vorzugsgeschwindigkeit der Neurone auswirkte, wurden die geschwindigkeiten vor Verabreichung der Fentanyl-Boli den Vorzugs-geschwindigkeiten nach Fentanyl-Applikation gegenübergestellt. Dabei wurde der Zeitraum von null bis neunzig Minuten nach Fentanyl-Verabreichung gesamt dargestellt, bzw. in die einzelnen Bereiche 0 bis 30, 31 bis 60 und 61 bis 90 Minuten unterteilt.

Die entsprechende Vorgehensweise wurde für die Auswertung der reizgetriebenen und spontanen neuronalen Aktivität gewählt.

Neben der Applikationsform als Bolus wurde Fentanyl auch als Infusion verabreicht.

In den Auswertungen werden die Zeiträume vor Infusionsbeginn, während der Infusion – zum Teil in dreißigminütige Abstände gegliedert – und nach Ende der Infusion betrachtet.

An vier Versuchstagen wurden im SC elektrophysiologische Messungen über einen längeren Zeitraum durchgeführt, ohne dass Fentanyl verabreicht wurde. Die Daten

von sechs units, die insgesamt sieben Messreihen lieferten, wurden ebenfalls in ihrem zeitlichen Verlauf dargestellt, wobei jeweils auf den Mittelwert der ersten zwei Messungen normiert wurde. Wiederum wurden Vorzugsgeschwindigkeit, reizgetriebene Aktivität und Spontanaktivität ausgewertet.

Die jeweilige Aufbereitung und Auswertung der Daten erfolgte unter Verwendung der Software SigmaStat 2.0^® und SigmaPlot 5.0^®, sowie mit unter Matlab 5.3^® selbst programmierten Funktionen. Die verwendeten statistischen Verfahren finden jeweils in Kapitel IV Erwähnung.

3.3 Verbleib der Versuchstiere nach Ende der elektrophysiologischen