Verwendete Bibliotheken

Für die physikalische Kartierung wurde eine genomische Cosmid-Bibliothek verwendet, die eine 17-fache Abdeckung des Gesamtgenoms aufwies. Zu einem späteren Zeitpunkt wurde zusätzlich eine genomische BAC-Bibliothek, die 15 Genom-Äquivalente bein-haltete, herangezogen.

Der Vorteil bei der Verwendung einer BAC-Bibliothek liegt in der Klonierbarkeit von grösseren DNA-Fragmenten. Dadurch kann der zu kartierende Abschnitt durch eine geringere Anzahl an überlappenden Klonen abgedeckt werden als bei der Verwendung von Klonbibliotheken mit kleinen Fragmenten. Während die Grösse von Fragmenten, die in Cosmide kloniert werden können, bedingt durch die DNA-Menge, die maximal in den Kopf des Bacteriophagen λ verpackt werden kann, auf etwa 40-50 kb limitiert ist,

konnten in BACs schon bis zu 1Mb grosse DNA-Fragmente kloniert werden (Cai et al., 1995). Üblicherweise liegt die Fragmentgrösse von BAC-Bibliotheken jedoch bei durchschnittlich 300 Mb. Die Inserierung solch grosser Fragmente wird unter anderem dadurch ermöglicht, dass die Transformation von BACs in den Wirt E. coli durch Elek-troporation mit grosser Effizienz durchführbar ist (Shizuya et al., 1992). Das Klonie-rungssystem ist damit unabhängig von einer Verpackung in Bacteriophagen und die damit verbundene Grössenselektion. Da die BAC-Vektoren auf dem F-Plasmid (engl.

fertility) des Bakteriums E. coli basieren, unterliegen sie dessen strenger Replikations-kontrolle und liegen daher in nur in 1-2 Kopien pro Zelle vor. Eine Folge dieser Repli-kationskontrolle ist die grosse Stabilität der Klone über viele Generationen hinweg. Bei den inserierten Fragmenten kommt es trotz ihrer Grösse weniger zu Rekombination, Insertion oder Deletion von DNA-Bruchstücken, wie dies häufig bei anderen Klonie-rungsvektoren der Fall sein kann.

Cosmid-Vektoren, die dagegen in hoher Kopienzahl pro Zelle vorliegen, haben den Nachteil, dass einige Sequenzen, die bedingt durch die hohe Kopienzahl zur Instabilität der Klone führen, folglich nur schwer klonierbar sind. Dazu gehören vor allem repetiti-ve Sequenzen.

Ein wichtiges Kriterium für Bibliotheken, die zur physikalischen Kartierung durch Hy-bridisierung verwendet werden, ist, dass sie den zu kartierenden Bereich in überlappen-den Fragmenten repräsentieren. Nur durch diese Überlappungen ist die Iüberlappen-dentifikation benachbarter Klone möglich. Ein als Sonde verwendeter Klon kann benachbarte Klone in einer Hybridisierung nur dann detektieren, wenn der Überlappungsgrad mehr als 30%

beträgt (J. Hoheisel, persönliche Mitteilung). Bei beiden verwendeten Bibliotheken wurde die zu klonierende DNA durch Partialrestriktion mit einer Restriktionsendonu-klease fragmentiert. Durch den partiellen Charakter der Restriktion wird gewährleistet, dass überlappende Fragmente unterschiedlicher Länge entstehen. Bedingt durch die zeitliche Begrenzung der Reaktion wird die DNA nicht vollständig fragmentiert, son-dern nur an einzelnen, zufällig verteilten Schnittstellen. Nachteil dieser Methode ist, dass die Schnittstellen der jeweiligen Restriktionsendonuklease nicht gleichmässig im Genom verteilt sind. So kann es grosse Bereiche ohne die jeweiligen Schnittstellen ge-ben, die folglich nicht fragmentiert werden können und somit aufgrund ihrer Grösse nicht kloniert werden.

zu können (Hoheisel et al., 1993). Die tatsächliche Abdeckung entlang eines Chromo-soms kann aus diversen Gründen sehr stark variieren (Hoheisel et al., 1995; Frohme et al., 2000). Bei einer geringen statistischen Redundanz ist es daher leicht möglich, dass einzelne Regionen gar nicht oder nur unzureichend in der Bibliothek repräsentiert sind.

Für eine gleichmässigere Abdeckung kann nicht nur eine höhere Redundanz, sondern auch die Verwendung von mehr als einer Bibliothek sorgen. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit sowohl eine Cosmid- als auch eine BAC-Bibliothek verwendet, die sich nicht nur im verwendeten Klonierungsvektor und damit in der Insertgrösse unter-schieden, sondern auch in der Fragmentierung der inserierten DNA. Im Fall der Cos-mid-Biblothek wurde die Fragmentierung mit der Restriktionsendonuclease MboI durchgeführt wurde, bei der BAC-Bibliothek dagegen wurde EcoRI verwendet. Eine gute Alternative wäre auch die Verwendung einer Bibliothek gewesen, deren klonierte DNA durch mechanische Scherung, etwa durch Ultraschallbehandlung, fragmentiert wurde. Die durch Scherung entstehenden Fragmente sind sequenzunabhängig über den zu kartierenden Abschnitt verteilt, man kann also eine sehr gleichmässige Abdeckung erwarten. Da aber eine Klonierung von durch Scherung erhaltenen Fragmenten sehr ineffizient ist, wurde in der vorliegenden Arbeit auf die Generierung einer solchen Bi-bliothek verzichtet.

Ein weiteres Qualitäts-Kriterium einer zum physikalischen Kartieren verwendeten Bi-bliothek ist ein möglichst geringer Gehalt an chimären Klonen. Dadurch, dass ein chi-märer Klon zwei DNA-Fragmente enthält, die aus verschiedenen Regionen des Genoms stammen, täuscht er in der Hybridisierung Überlappungen von Klonen oder contigs vor, die in Wirklichkeit nicht bestehen. Bei der Erstellung der Cosmid-Bibliothek wurden deshalb verschiedene Massnahmen ergriffen, um die Enstehung chimärer Klone zu ver-hindern: die Ligation zweier genomischer Fragmente miteinander wurde zum einen durch eine zuvorige Dephosporylierung der Fragmente unterbunden, zum anderen durch einen deutlichen Überschuss des Cosmid-Vektors während der Ligation. Ausserdem wurden die Bedingungen der Partialrestriktion so gewählt, dass hauptsächlich grosse Fragmente entstanden, die aufgrund der durch die Verpackung in λ-Phagenköpfe gege-benen Grössenselektion nur einzeln kloniert werden konnten. Bei der Verwendung von BACs als Klonierungsvektor konnte gezeigt werden, dass die Anzahl an gebildeten chimären Klonen üblicherweise sehr gering ist (Zimmer & Gibbins, 1997). Im Laufe der Kartierung und später auch der Sequenzierung wurde festgestellt, dass etwa 10%

aller Klone aus beiden Bibliotheken trotz der im Vorfeld ergriffenen Massnahmen

chi-mär sind. Chichi-märe Klone, die als Sonden verwendet werden, können meist recht leicht in der Karte anhand ihres Hybridisierungsmusters detektiert werden, da sie als einzige Sonde zwei contigs miteinander verknüpfen. Diese Verknüpfung kann aber meist durch die Hybridisierungsdaten anderer Sonden nicht bestätigt, teilweise sogar widerlegt wer-den. Chimäre Klone, die nicht als Sonde verwendet wurden, sondern als positiver Klon bei einer Hybridisierung detektiert werden, führen zu einem erhöhten Hintergrund an falsch-positiven Klonen, oft werden aber auch hier die scheinbaren Verknüpfungen durch die Hybridisierung anderer, nicht-chimärer Sonden widerlegt.