3. Ergebnisse
3.1.7. Sequenzanalyse
Bisher wurden bei MWG Biotech AG 3,5 Mb von Chromosom II und 4,2 Mb von Chromosom V sequenziert. Das entspricht 76% von Chromosom II und 46% des Chromosom V. Die Assemblierung und Annotierung der Sequenzdaten erfolgte bei MIPS (Martinsried Institute for Protein Sequences).
Bei der Analyse der bisher erhaltenen Sequenzen von Chromosom II und V konnten insgesamt 2256 offene Leserahmen (engl. „ORF“= open reading frame) identifiziert werden (http://www.mips.biochem.mpg.de/proj/neurospora/). Durch ausführliche Da-tenbankvergleiche erfolgte eine Klassifikation der ORFs entsprechend ihrer Homologie zu bereits bekannten Proteinen nach einem bei MIPS entwickelten System in sechs Klassen. Danach konnten 94 ORFs (4%) einem bekanntem Protein zugeordnet werden, 41 davon auf Chromosom II, 53 auf Chromosom V (G. Mannhaupt, persönl. Mittei-lung). Diese sind in den Tabellen 3.4 und 3.5 aufgeführt. Von diesen bekannten Protei-nen haben nur 19 eiProtei-nen kartierten Gen-Locus auf Chromosom II, 25 sind als Locus auf Chromosom V kartiert (Perkins et al., 2000).
Tabelle 3.4: Gene, die bei der Sequenzanalyse auf Chromosom II lokalisiert wurden
Klon/contig bac24m22 792 Vermutlich C6 Zink-Cluster Transkriptionsfaktor
bac24m22 412 homolog zu Alkohol-Dehydrogenase bli-4
bac23h20 977 Glycin-reiches Protein het-COR
bac23h20 571 RNA-Splicingfaktor pad-1
bac23h20 397 Orotidin-5-phosphatdecarboxylase pyr-4
bac23b10 115 Vacuolare ATP-Synthase, Untereinheit G bac23b10 1287 DNA-abhängige RNA-Polymerase II RPB140 bac10k17 1132 Leucin-tRNA-Ligase, cytosolisch
bac10k17 449 alpha-Tubulin B
bac11o9 760 rekombinatorisches Reparatur-Protein mus-23
bac12n19 572 Aminosäurenpermease NAAP1
bac17c10 744 NADH-Dehydrogenase (Ubichinon) 78K-Ketten-Vorläufer
bac17c10 439 Actin-verwandtes Protein 3 arp3
bac18e6 646 Hitzeschockprotein 70 hsp70
bac19c19 290 Ribosom-assoziiertes Protein Rap-1
bac19c19 364 H+-transportierende ATPase, Vakuole, 41 kDa-Untereinheit bac1d1 920 H+-transportierende ATPase
bac1d1 469 mitochondriale Citratsynthase
Fortsetzung Tabelle 3.4
bac24h17 483 negativer Regulationfaktor preg
bac2a19 929 Ribonucleosid-Diphosphatreductase, grosse Kette un-24
bac2a19 236 regulatorisches Protein cys-3
bac7n14 454 Ubichinol-Cytochrom C-reductase Komplex Protein 2-Vorläufer bac8b20 171 Cytochrom C-Oxidase, Kette V-Vorläufer
bac8b20 519 H+-transportierende ATP-Synthase (EC 3.6.1.34), beta-Kette
bac8b8 354 Allantoicase
bac8j24 856 Vacuolare ATP-Synthase, 98 Kda-Untereinheit
bac8l21 1300 Dynactin (150 KDa Dynein-assoziiertes Polypeptid) ro-3
bac9g16 338 Glyceraldehyd- 3-phosphatdehydrogenase ccg-7
bac9j10 203 GTP-bindendes Protein ypt1
Tabelle 3.5: Gene, die bei der Sequenzanalyse auf Chromosom V lokalisiert wurden
Klon/contig
2e4 624 Mitochondriales Vorläufer-Protein, Import-Rezeptor tom70
2e4 380 Centractin ro-4
g65a3 888 Chitinsynthase 3 chs-3
18a7 927 Transkriptionsaktivator-Protein acu-15
65e11 324 Regulator der Conidiation rca-1
21d9 152 Nucleosiddiphosphatkinase
18f11 245 Mangansuperoxid-Dismutase, Vorläufer sod-2
18f11 607 H+-transportierende ATPase, vacuolar, 67K-Kette
18f11 454 Glutamatdehydrogenase NADP+
g15d1 744 neutrale Trehalase alpha,alpha-Trehaloseglucohydrolase
15e11 668 alkalische Phosphatase
bac8g12 197 Dynactin Arp1 p25-Untereinheit RO12
64c2 661 Clock-controlliertes Gen 8 ccg-8
93g11 71 Glucose-repressierendes Protein grg-1
17e5 369 vermutlich Protein-Disulfidisomerase-Vorläufer
Fortsetzung Tabelle 3.5
bac11o8 797 Komplex I-Intermediat-assoziiertes Protein CIA84, Vorläufer 20h10 202 NADH-Dehydrogenase Ubichinon 29/21K-Ketten-Vorläufer 20h10 107 Ubichinol-Cytochrome-C-Reductase, Kette VIII
123a4 347 Farnesylpyrophosphatsynthetase
123a4 263 NADH-Ubichinon-Oxireductase, 24 kDa-Untereinheit-Vorläufer nuo24
123a4 385 CAMP-abhängige Proteinkinase, regulatorische Kette mcb
123a4 1032 Transkriptions-Elongations-Komplex, Untereinheit CDC68
bac14a6 503 S-Adenosylmethionindecarboxylase spe-2
bac14a6 696 L-Aminosäure-Oxidase
7f4 706 Glycogensynthase
99h12 517 Phosphoprotein-phosphatase, 3-alpha katalytische Kette 99h12 149 ribosomales Protein L27a.e
bac8p8 142 Clock-controlliertes Gen 6 ccg-6
bac8p8 643 Ascosporen-Maturation-1-Protein Asm-1
Von den übrigen identifizierten offenen Leserahmen weisen 644 ORFs (29%) Ähnlich-keit mit einem bekannten Protein auf, weitere 242 ORFs (11%) haben sogar eine grosse Ähnlichkeit mit einem bekannten Protein. Ähnlichkeit mit einem unbekanntem Protein war bei 568 ORFs (25%) zu finden, Ähnlichkeit mit einem nicht näher charakterisierten EST bei 115 ORFs (5%). Bei 592 ORFs (26%) konnte keinerlei Homologie zu bereits bekannten Proteinen festgestellt werden, hier handelt es sich also um völlig neue Gene.
Abb. 3.11: Klassifikation der bisher identifizierten offenen Leserahmen auf Chr. II und V nach ihrer Homologie.
Eine Klassifikation der vorhergesagten offenen Leserahmen hinsichtlich ihrer Protein-funktion ergab, dass ca. 12% (264) für den Stoffwechsel zuständig sind, 2% (46) für den Energiehaushalt, 7% (160) für Zellwachstum, Zellteilung und DNA-Synthese, 7% (153) für die Transkription und 3% (59) für die Proteinsynthese. 52% (1177) sind bisher nicht klassifiziert, die restlichen Proteine übernehmen Funktionen wie zelluläre Organisation, Signaltransduktion, Transportmechanismen oder Zellverteidigung, Alterungsprozesse und Zelltod (17%).
Untersuchungen der bisher sequenzierten Genom-Abschnitte ergaben, dass die Gen-dichte bei etwa 4 kb pro Gen liegt (G. Mannhaupt, mündliche Mitteilung; Nelson et al., 1997). Legt man die daraus folgenden Schätzungen zugrunde, dass sich die Gesamtzahl der Gene von N. crassa auf etwa 10-12.000 Gene beläuft, wurden auf den Chromoso-men II und V, die zusamChromoso-men etwa ein Drittel der Länge des Genoms ausmachen, bisher zwischen 19 und 23% aller Gene identifiziert. Da aber weder die vollständige Sequenz beider Chromosomen vorliegt, noch alle vorliegenden Sequenzen analysiert und anno-tiert wurden, ist diese Zahl zum gegenwärtigen Zeitpunkt bei weitem nicht vollständig.
Desweiteren ergab sich, dass bei 75% der untersuchten Gene kein oder nur ein Intron gefunden wurde. Diese Introns weisen eine durchschnittliche Länge von 50-100 kb auf.
Die eingehendere Analyse der Gene mit bisher unbekannter Funktion, in denen sich N.
crassa von allen bisher sequenzierten Organismen, vor allem aber auch von der sehr nah verwandten Hefe S. cerevisiae unterscheidet, lässt viele neue Erkenntnisse über die Biologie filamentöser Ascomyceten erwarten.
3.2. Genexpressionsanalysen
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden Genexpressionsanalysen mit Hilfe der DNA-Chip-Technologie durchgeführt. Ausgehend von einer cDNA-Bibliothek, die vom amerikanischen Neurospora Genome Project zur Verfügung gestellt wurde, wurden DNA-Chips hergestellt. Für die Genexpressionsanalysen wurden exemplarisch drei ver-schiedene Wachstumsbedingungen für Mycel von N. crassa ausgesucht. RNA-Proben aus diesen Mycelien wurden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und paarweise auf die Chips hybridisert. Durch intensive bioinformatische Analyse der Hy-bridisierungsdaten wurden die Transkriptionsprofile der Proben erstellt und in einer Korrespondenz-Analyse miteinander verglichen.
Darüberhinaus wurde auf dem N.crassa-DNA-Chip eine Probe aus S. cerevisiae mit einer Probe aus N. crassa verglichen. Dieser Versuch diente der Validierung der Quali-tät der hergestellten DNA-Chips.
3.2.1.PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek
Zunächst wurden die klonierten Fragmente der cDNA-Bibliothek wie in 2.3.2. be-schrieben mittels PCR amplifiziert. Die cDNA-Bibliothek lag in 15 Mikrotiterplatten im 384er Format vor, die Amplifikation erfolgte daher ebenfalls in 384er PCR-Platten. Jede Mikrotiterplatte wurde in dreifacher Kopie amplifiziert. Dadurch wurde sichergestellt, dass trotz des geringen Reaktionsvolumen von je 25 µl in den 384er-PCR-Platten genü-gend Material für die Herstellung der DNA-Chips zur Verfügung stand. Startpunkte für die Amplifikation waren Vektor-spezifische Oligonukleotide („T7“ und „T3“), durch die gewährleistet wurde, dass ausschliesslich die Sequenz des klonierten cDNA-Fragments amplifiziert wurde und nicht Teile des Vektors selbst. Die Effizienz der PCR-Reaktionen wurde in einem 1%igem Agarosegel überprüft. Insgesamt konnten ca.
96% aller cDNA-Klone amplifiziert werden.
Abb. 3.12: Gelelektrophoretische Analyse der PCR-Amplifikation. Gezeigt sind exemplarisch 96 PCR-Produkte. In den Spuren M wurde der Marker (GeneRuler) aufgetragen.
Nur wenige Spuren enthalten keine Bande, bei zwei Spuren sind zwei Banden zu erken-nen, wahrscheinlich lag hier eine Kontamination mit einem zweiten cDNA-Klon vor.
3.2.2.Herstellung heterologer Kontrollen
Durch die Verwendung heterologer Kontrollen, die sowohl in Form von DNA-Fragmenten als Sonde auf die Chips aufgebracht werden, als auch als mRNA in defi-nierter Menge zur Markierungsreaktion der Probe hinzugefügt werden, ist eine Norma-lisierung der Hybridisierungen leichter möglich, da diese Kontrollen feste Bezugs-punkte für die Datenanalyse liefern (Eickhoff et al., 1999). Dadurch, dass die gemesse-nen Signalintensitäten für diese Kontrollen immer konstant sein müssen, wird der Ver-gleich von Datensätzen verschiedener Herkunft erleichtert. Wird die Kontroll-Sonde in mehreren Verdünnungen aufgebracht, erhält man entsprechend Bezugspunkte für ver-schieden starke Signalintensitäten.
Sequenzen, die als heterologe Kontrollen verwendet werden, dürfen keine Homologien zum zu untersuchenden Organismus aufweisen, da sonst mit Kreuzhybridisierungen zu rechnen wäre. Eine Kreuzhybridisierung würde zu Verfälschungen in der resultierenden Signalintensität führen und somit die Verwendbarkeit als Bezugspunkt für die Normali-sierung erheblich beeinträchtigen. Als N. crassa-fremde Kontrolle wurde Kanincheng-lobin gewählt. Zum einen ist die Sequenz des GKanincheng-lobins bei Säugetieren zwar stark kon-serviert, beim Pilz N. crassa bisher jedoch nicht bekannt. Zum anderen ist die mRNA von Kaninchenglobin kommerziell verfügbar und kann somit direkt als Probe verwen-det werden. Um sicherzustellen, dass es bei der Verwendung von Kaninchenglobin als heterologe Kontrolle nicht zu Kreuzhybridisierungen mit N. crassa-DNA kommen kann, wurde die Sequenz des Kaninchenglobins zunächst mit Hilfe des BLAST-Algorithmus („basic local alignment search tool“, Altschul et al., 1990) mit der bisher
M M
bekannten genomischen Sequenz von N. crassa verglichen. Dabei wurden keine Über-einstimmungen festgestellt. Zusätzlich wurde markierte mRNA aus Kaninchenglobin auf den Neurospora-DNA-Chip hybridisiert, wobei keine Kreuzhybridisierungen detek-tiert werden konnten (Ergebnisse nicht gezeigt).
Wie in 2.3.3. beschrieben, wurde zunächst ausgehend von Kaninchenglobin-mRNA eine cDNA-Erststrangsynthese durchgeführt. Diese cDNA diente dann in einem zweiten Schritt als Matrize für die Amplifikation eines α- bzw. β-Globin-spezifischen Frag-ments mittels PCR. Nach der Reinigung der PCR-Produkte wurde je ein Aliquot gele-lektrophoretisch auf Grösse und Qualität überprüft.
Abb. 3.13: Gelelektrophoretische Analyse der PCR-Produkte der heterologen Kontrollen aus Ka-ninchen-Globin. In Spur M wurde der Marker (GeneRuler) aufgetragen. Spur 1 enthält das 268 bp grosse ααα-Globin-spezifische PCR-Produkt, Spur 2 das 490 bp grosse α ββββ-Globin-spezifische PCR-Produkt.
3.2.3.Herstellung der DNA-Chips
Für die Herstellung der DNA-Chips wurden zunächst Objektträger mit Poly-L-Lysin beschichtet (2.3.4.1.). Anschliessend wurden wie in 2.3.4.2. beschrieben mit Hilfe des Roboters SDDC-2 MicroArrayer die PCR-Produkte in einem definierten, hochdichten Raster aufgebracht, wobei während eines Roboter-Laufs 50 Chips gleichzeitig herge-stellt werden konnten. Anschliessend wurden die DNA-Chips einer Blockierungsreakti-on unterzogen, bei der freie Amin-Gruppen vBlockierungsreakti-on Poly-L-Lysin durch ReaktiBlockierungsreakti-on mit
M 1 2
490 bp 268 bp 500 bp
200 bp
Stellen, an denen keine Sonden-DNA aufgebracht wurde, zu unspezifischen Hybridisie-rungen kommen kann, die zu einem erhöhten Hintergrund führen.
3.2.4.Isolierung von RNA aus Neurospora crassa
Für die Isolierung der RNA aus den drei Mycel-Proben „Vollmedium“, „Minimalmedi-um“ und „Acetat“ wurden zunächst die Zellen durch Pulverisieren des gefrorenen My-cels im Mörser aufgeschlossen und anschliessend durch Zugabe von SDS lysiert. Nach einer Phenolextraktion wurde die RNA mit LiCl gefällt (siehe 2.3.6.). Die Qualität der RNA wurde in einem 1,2%igen Agarosegel unter denaturierenden Bedingungen über-prüft.
Abb. 3.14: RNA aus den Mycelproben 1) Vollmedium; 2) Minimalmedium und 3) Acetat
Aufgetragen wurden nach fluorimetrischer Konzentrationsbestimmung je 1 µg RNA. Zu erkennen sind deutlich die Banden der ribosomalen RNA. Die RNA ist nicht degradiert, da keine Abbauprodukte im niedermolekularen Bereich zu sehen sind.