Generierung der Hybridisierungsdaten

Die RNA-Proben wurden markiert, indem durch reverse Transkription unter Verwen-dung von Aminoallyl-dUTP einzelsträngige cDNA synthetisiert wurde. In einem zwei-ten Schritt wurden reaktive Fluoreszenzfarbstoffester an das eingebaute Amino-allyl-dUTP gekoppelt (siehe 2.3.7.). Die durch Absorptionsmessung bestimmte Einbaurate lag typischerweise bei 1-2%. Die Hybridisierungen erfolgten wie in 2.3.8. beschrieben

1 2 3 1 2 3

als Zweifarben-Experiment. Bei den Experimenten zur Genexpression bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien wurde jede Hybridisierung viermal wiederholt. Die Probe

„Vollmedium“ wurde jeweils als Kontrolle eingesetzt, die mit der Probe „Minimalme-dium“ bzw. „Acetat“ cohybridisiert wurde. Dabei wurden die einzelnen Proben je zweimal mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 und zweimal mit Cy5 markiert. Durch die viermalige Wiederholung sollte eine statistische Validierung der Ergebnisse erreicht werden (Lee et al., 2000). Darüber hinaus sollten durch den Wechsel des Farbstoff Ab-weichungen durch unterschiedliches Verhalten der beiden Fluoreszenzfarbstoffe bei Markierung und Detektion ausgeglichen werden (Taniguchi et al., 2001).

Die Hybridisierung zum Vergleich von N. crassa mit S. cerevisiae wurde aufgrund mangelnden RNA-Materials nur zweimal wiederholt, ebenfalls mit Austausch der bei-den Fluoreszenzfarbstoffe.

Nach Hybridisierung und Waschen wurden die Glas-Chips direkt detektiert, wobei auf-grund der geringeren Photostabilität immer die durch Cy5 erhaltenen Signale zuerst detektiert wurden.

Abb. 3.15: Gesamt-Chip und Ausschnittsvergrösserung nach Detektion der durch Cy3 erhaltenen Signale nach der Hybridisierung von Cy3-markierter Probe "Vollmedium".

Signalintensität

Die erhaltenen Signalintensitäten wurden mit der Software GenePix^™ quantifiziert.

Abb. 3.16: Ausschnitt eines Chips in der Darstellung von GenePix, auf den die Cy3-markierte Pro-be "Vollmedium" zusammen mit der Cy5-markierten ProPro-be "Minimalmedium" hybri-disiert wurde. Die Software GenePix überlagert die in Falschfarben dargestellten Bilder, die durch Detektion des Cy3-Kanals (=grün) und des Cy5-Kanals (=rot) resultieren und quantifiziert die Signalintensitäten.

Die Ergebnisse aus GenePix^™ wurden in Form einer Tabelle abgespeichert, in der jeder Sonde die zugehörigen Signalintensitäten für den Cy3- und den Cy5-Kanal sowie der Wert für die Intensität des lokalen Hintergrunds zugeordnet wurden. Diese Daten dien-ten als Grundlage für die Auswertung mit der Software M-Chips.

3.2.6.Datenanalyse mit M-Chips

Für die Datenanalyse mit M-Chips (Fellenberg et al., 2001) wurden zunächst die durch die Quantifizierung mit GenePix^™ erhaltenen Signalintensitäten für jede einzelne Hy-bridisierung in die Datenbank geladen. Wiederholungen von HyHy-bridisierungen unter gleichen Bedingungen wurden dabei zu Experimenten zusammengefasst. Experimente können mit M-Chips einzeln, aber auch in Kombination mit anderen Experimenten analysiert werden. Wurden die Hybridisierungen wie in der vorliegenden Arbeit als Zweifarben-Experiment durchgeführt, ist es von grosser Relevanz, dass bei den kombi-nierten Experimenten jeweils die gleiche Kontrollbedingung gewählt wurde. Ansonsten sind die Experimente durch den kompetitiven Charakter der Hybridisierungen nicht miteinander vergleichbar.

Der erste Schritt der Datenanalyse besteht in der Normalisierung der Daten. Dazu wer-den paarweise die Signalintensitäten der zu vergleichenwer-den Datensätze in einem

Koor-dinatensystem gegeneinander aufgetragen. Anschliessend wird durch die Datenpunkte eine Regressionsgerade gelegt. Grundlage für die Berechnung dieser Gerade war ein Algorithmus, der eine signifikante Mehrheit aller Datenpunkte verwendet. Diese Me-thode hatte sich schon in früheren Projekten in unserer Arbeitsgruppe (A. thaliana, M. Scheideler; S. cerevisiae, N. Hauser) als robuster gegenüber der Be-rechnung unter der Verwendung von heterologen Kontrollen erwiesen. Durch multipli-kative und additive Korrektur wird die Regressionsgerade so angepasst, dass sie mit einer Steigung von 1 durch den Ursprung des Koordinatensystems verläuft. Dadurch erhält man die normalisierten Signalintensitäten für beide zu vergleichenden Bedingun-gen (siehe 2.3.9.3.).

Anschliessend erfolgt eine Filterung der Daten, um die grosse Menge der anfallenden Daten auf diejenigen Gene zu reduzieren, die eine signifikante Änderung in ihrer Ex-pression zeigen. Die gemessenen Daten wurden durch Wiederholung auf zwei verschie-denen Ebenen erhalten. Zum einen war jede Sonde doppelt auf den Chip aufgebracht worden, so dass man bei einer Hybridisierung zwei Datenpunkte für jedes Gen erhielt.

Zum anderen wurden die Hybridisierungen zwei- bzw. viermal wiederholt, so dass man insgesamt für jedes Gen vier bzw. acht Datenpunkte erhielt. Die Wiederholung von Ex-perimenten ermöglicht durch die entstehende Redundanz eine statistische Validierung der Ergebnisse. Desweiteren erlaubt eine grössere Datenmenge eine genauere Definition eines Signalintensitätsschwellenwertes, der auswertbare Signale vom Hintergrundrau-schen trennt. Durch verschiedene Filterkriterien (siehe unten) wurden Daten ohne Rele-vanz aus dem Datensatz entfernt, so dass nur Daten, die eine Änderung im Expressions-profil charakterisieren, für weitere Analysen verwendet wurden. In der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt drei verschiedene Filterkriterien verwendet: zum einen wur-den die Daten anhand eines Signalintensitätsschwellenwertes gefiltert, zum anderen wurden nur solche Daten verwendet, bei denen, gemessen am Verhältnis der Signalin-tensitäten beider Fluoreszenzfarbstoffe zueinander, eine Änderung der Genexpression vorlag, zum dritten erfolgte eine Filterung nach der Stringenz der Änderung (Beißbarth et al., 2000).

Mit den gefilterten Daten kann im Anschluss eine Korrespondenzanalyse (Fellenberg et al., 2001) durchgeführt werden, alternativ stehen auch noch andere cluster-Algorithmen wie der des hierarchischen Clusterns zur Verfügung.

Farbkodierte Liste mit Induktions-/Repressionsfaktoren

Aus dem Verhältnis der normalisierten Signalintensitäten der Probe unter Testbedin-gung zu den Intensitätswerten der Probe unter der KontrollbedinTestbedin-gung wird der Grad der differentiellen Expression ermittelt. Die Signalintensitätsverhältnisse werden umge-rechnet in Faktoren mit positivem Vorzeichen für die Induktion und Faktoren mit nega-tivem Vorzeichen für die Repression eines Gens. Diese Faktoren werden in Form einer farbkodierten Tabelle ausgegeben. Hierbei sind die Induktions- und Repressionsfakto-ren je nach Stringenz der Genexpressionsänderung farblich unterlegt. Folgt die Ände-rung statistisch signifikant dem hochstringenten "Min/Max-Separation"-Kriterium (sie-he 2.3.9.3.), sind die Faktoren für eine Induktion rot unterlegt, für eine Repression blau.

Ist die Änderung der Genexpression durch das weniger stringente "Standardabwei-chung-Separation"-Kriterium belegt, sind die Induktionsfaktoren gelb unterlegt, die Repressionsfaktoren hellblau. Konnten die Ergebnisse durch keine dieser beiden Quali-tätskriterien gesichert werden, erfolgt keine farbliche Unterlegung der Faktoren.