3. Ergebnisse
3.1.3. Selektion Chromosom II-spezifische BAC-Bibliothek
Da die BAC-Bibliothek erst zu einem späteren Zeitpunkt zur Verfügung stand, an dem die Kartierung von Chromosom V auf Cosmid-Ebene schon weit fortgeschritten war, wurde darauf verzichtet, eine Chromosom V-spezifische BAC-Bibliothek zu selektie-ren. Dagegen wurde für die Kartierung von Chromosom II eine Auswahl der Chromo-som II-spezifischen BAC-Klone vorgenommen.
Da für eine Hybridisierung von chromosomaler DNA analog zu 3.1.2. nicht mehr genü-gend Material vorhanden war, wurde zur Selektion der chromosomenspezifischen BAC-Bibliothek eine andere Strategie gewählt: 190 zufällig ausgewählte Klone der Chromo-som II-spezifischen Cosmid-Bibliothek wurden mit Digoxigenin-11-dUTP markiert und auf die gesamt-genomische BAC-Bibliothek hybridisiert. Dadurch konnten insgesamt
751 BAC-Klone identifiziert werden, die in 2 Mikrotiterplatten im 384er Format über-führt wurden. Durch die Hybridisierung weiterer Chromosom II-spezifischer Cosmid-Klone konnten keine neuen BAC-Cosmid-Klone identifiziert werden, so dass man die Selektion nach der Hybridisierung von 190 Cosmid-Sonden beendete. Bei einer durchschnittli-chen Insertgrösse von 69 kb hat die Chromosom II-spezifische Bibliothek eine 11-fache theoretische Abdeckung.
Herstellung von DNA-Filtern der BAC-Sub-Bibliothek
Die Klone der Chromosom II-spezifischen BAC-Bibliothek wurden im 2x2-Raster auf je ein Feld der 22x22 cm grossen Nylon-Membranen transferiert.
3.1.4.Präparation von Cosmid-DNA
Die als Sonde für die physikalische Kartierung verwendete Cosmid-DNA wurde durch alkalische Lyse der E. coli-Wirtszellen und anschliessender Phenol-Extraktion wie in 2.2.6. beschrieben präpariert. Ein Aliquot der Ansätze wurde nach Restriktionshydroly-se auf einem AgaroRestriktionshydroly-segel elektrophoretisch hinsichtlich Qualität und Ausbeute der prä-parierten Cosmid-DNA überprüft.
Abb. 3.4: Spur M enthält den Marker (SmartLadder). In den Spuren 1)-12) wurde die DNA von 12 zufällig ausgewählten Cosmid-Klonen aufgetragen.
Das Gel zeigt, dass die DNA in allen 12 Ansätzen seine ausreichende Reinheit aufwies, um von der Restriktionsendonuklease EcoRI hydrolysiert zu werden. In einigen weni-gen Fällen konnte bei der Cosmid-DNA-Präparation nur sehr wenig (siehe Spur 2 in
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 kb 10 kb
3.1.5.Präparation von BAC-DNA
Während Cosmid-Vektoren in bis zu 50-facher Kopie pro E. coli-Zelle vorkommen, liegen BAC-Vektoren nur in ein- bis maximal zweifacher Kopie vor. Bei gleichem Ausgangsvolumen an Bakterienkultur ist die Ausbeute an Vektor-DNA bei einer BAC-DNA-Präparation daher sehr viel geringer als bei einer Cosmid-BAC-DNA-Präparation.
Durch einige Modifikationen konnte das bestehende Protokoll für den QIAprep® Spin Miniprep Kit soweit optimiert werden, dass bei geringem Zeitaufwand eine höhere Ausbeute an BAC-DNA als durch herkömmliche Minipräparationsprotokolle erhalten werden konnte. Neben der Verwendung eines grösseren Volumens an Bakterienkultur, der Steigerung der verwendeten RNase A-Konzentration und dem Austausch eines im Kit enthaltenen Puffers war vor allem die Fragmentierung der BAC-DNA durch die Restriktionsendonuklease EcoRI vor dem Auftrag auf die Anionenaustauscher-Säulen ein wichtiger Optimierungsschritt, da die Elution kleinerer Fragmente wesentlich effizi-enter ist als die der intakten BACs. Von jedem Ansatz wurde ein Aliquot gelelektropho-retisch auf Qualität und Ausbeute der BAC-DNA überprüft.
Abb. 3.5: Das Gel zeigt die DNA von vier zufällig ausgewählten BAC-Klonen. Spur M enthält den Marker (SmartLadder). Die Spuren a)-d) zeigen die DNA, die durch Präparation nach dem modifiziertem Protokoll gewonnen wurde (siehe 2.2.7.), die Spuren A)-D) zeigen die DNA nach Präparation durch das herkömmliche Protokoll des QIAprep® Spin Miniprep Kits.
Deutlich auf dem Gel zu sehen ist die erheblich geringere DNA-Menge in den Spuren A)-D). In den Spuren a)-d) ist im niedermolekularen Bereich degradierte Bakterien-RNA zu sehen, die trotz erhöhter Zugabe von RNaseA noch vorhanden ist.
M a b c d A B C D M
1 kb 10 kb
3.1.6.Physikalische Kartierung
Zur physikalischen Kartierung durch Hybridisierung werden einzelne Klone auf die Filter der zu kartierenden Klon-Bibliothek hybridisiert. Anhand der Hybridisierungsmu-ster können Klone mit überlappenden Sequenzen identifiziert werden. Daraus ergibt sich eine relative Anordnung der Klone zueinander, die eine sequenzabhängige Rekon-struktion des zu kartierenden DNA-Abschnitts darstellt.
Hybridisierung
Die Hybridisierungen zur Kartierung wurden in der Anfangsphase mit radioaktiv mar-kierten Sonden durchgeführt (siehe 2.2.8.). Hinsichtlich einer vereinfachten Handha-bung wurde jedoch bald dazu übergegangen, die Sonden mit Digoxigenin zu markieren und über Chemilumineszenz zu detektieren (siehe 2.2.9.). Die Markierung sowohl der radioaktiv markierten als auch der mit Digoxigenin markierten Sonden erfolgte durch Replikation der Sonden-DNA, wobei mit Hilfe einer DNA-Polymerase ausgehend von Hexamer-Oligonukleotiden entsprechend markierte Nukleotide eingebaut wurden ("random hexamer priming"). Die Detektion der durch radioaktive Sondenmarkierung erhaltenen Signale erfolgte auf Röntgenfilmen, die durch radioaktive Strahlung ge-schwärzt werden. Für die Detektion der mit Digoxigenin-markierten Sonden wurden die Klon-Filter nach entsprechenden Wasch- und Blockierungsschritten in einer Antikör-perlösung inkubiert. Dieser gegen Digoxigenin gerichtete Antikörper war mit alkali-scher Phosphatase konjugiert. Nach Bindung des Antikörpers wurden die Filter kurz in einer Lösung mit dem chemilumineszenten Substrat CSPD® inkubiert. Die alkalische Phosphatase reagiert mit CSPD®, wobei dieses zerfällt und Energie in Form von Licht freisetzt. Dieses Licht kann durch die Schwärzung von speziellen Lumi-Filmen detek-tiert werden.
Als Sonden wurden ausschliesslich Klone der Cosmid- und BAC-Bibliotheken ver-wendet.
Abb. 3.6: Hybridisierung auf Klonfilter. Exemplarisch sind gezeigt A) die Hybridisierung einer radioaktiv markierten Cosmid-Sonde auf einen Filter der Cosmid-Sub-Bibliothek von Chr. V und B) die Hybridisierung einer mit Digoxigenin markierten BAC-Sonde auf die genomische BAC-Bibliothek (Ausschnitt).
Auswertung
Die Autoradiographien bzw. die durch Chemilumineszenz belichteten Filme wurden manuell ausgewertet. Dazu wurden mit Hilfe einer transparenten Rastervorlage, die auf den Film gelegt wurde, die Koordinaten der Klone mit positivem Signal bestimmt. Ein Klon wurde nur dann als positiv gewertet, wenn beide zum Klon gehörenden Signale positiv waren. Die Herkunftsplatte der Klone ergab sich aus der relativen Anordnung der beiden Doppel-Signale zueinander (siehe Abb. 2.1). Anhand der Platten-Nummer und der Koordinaten konnten die Klone eindeutig identifiziert werden. Eine Betrach-tung der Signalintensität war insofern für die AuswerBetrach-tung irrelevant, da nur zwischen positivem und nicht-positivem Signal unterschieden wurde. Für jede Hybridisierungs-sonde wurde eine eigene Textdatei erstellt, die mit dem Namen der Sonde bezeichnet wurde und die Namen aller Klone mit positivem Hybridisierungssignal für diese Sonde beinhaltete. Diese Textdateien dienten als Berechnungsgrundlage für das Softwarepaket
A A)
B)
"Contig" (Mott et al., 1993). Aus der Anzahl von gemeinsam getroffenen Klonen wur-den für jede mögliche Sonwur-denpaarkombination Distanzwerte berechnet (siehe 2.2.10.).
Anschliessend wurde die Sondenreihenfolge kalkuliert, die den kleinsten Wert für die Gesamtdistanz aufweist. Anhand dieser Sondenreihenfolge wurden die Klone einem zweiten Schritt entsprechend ihrem Hybridisierungsmuster angeordnet. Die Darstellung der so berechneten physikalischen Karte erfolgte in einer zweidimensionalen Matrix.
Die Sonden sind in den Zeilen dargestellt, die Spalten beinhalten, dargestellt durch schwarze Balken, die bei der Hybridisierung der jeweiligen Sonde positiven Klone (Abb. 3.8).
Kartierungsstrategie Chromosom II
Folgende Bibliotheken wurden für die physikalische Kartierung von Chromosom II verwendet:
Tabelle 3.2: Bibliotheken, die zur physikalischen Kartierung von Chr. II verwendet wurden
Bibliothek Anzahl Klone Insertgrösse II-spezifische BAC-Bibliothek als auch die Chromosom II-II-spezifische Cosmid-Bibliothek verwendet (siehe Abb. 3.7). Zunächst wurden nur BAC-Klone als Sonden verwendet.
Die Sonden wurden fortlaufend aus den Mikrotiterplatten, beginnend mit Mikrotiter-platte 1, ausgewählt, wobei ab der zweiten Hybridisierungsrunde nur diejenigen Klone als Sonde verwendet wurden, die in den vorherigen Hybridisierungsexperimenten noch kein positives Signal aufwiesen. Durch dieses als "sampling without replacement" be-zeichnete Verfahren wurde ermöglicht, dass nach nur 50 Hybridisierungen 96 % der Klone in mindestens einer Hybridisierung detektiert werden konnten. Anschliessend
hängender Klone (="contigs") lagen, um eventuelle Anschluss- oder Verbindungsklone zu anderen contigs zu finden. Als keine signifikanten Fortschritte beim Schliessen der Lücken mehr erzielt werden konnten, wurden die Sonden nicht mehr auf die Sub-Bibliotheken, sondern auf Filter mit den gesamt-genomischen Bibliotheken hybridisiert.
Somit sollte sichergestellt werden, dass auch diejenigen Chromosom II-Klone detektiert werden, die bei der Selektion der Sub-Bibliotheken nicht erfasst worden waren.
Abb. 3.7: Kartierungsstrategie Chromosom II
Nach der Hybridisierung von insgesamt 191 BAC-Klonen und 273 Cosmid-Klonen resultierte schliesslich eine physikalische Karte, die nur noch 13 contigs beinhaltete. Die relative Anordnung der einzelnen contigs zueinander erfolgte durch den Vergleich mit der genetischen Karte (Perkins et al., 2000). Dabei wurden die contigs so angeordnet, dass die Reihenfolge der durch Sequenzanalyse einzelner Klone gefundenen Gene mit der Reihenfolge der Genloci in der genetischen Karte übereinstimmt.
1.) „sampling without replacement“
2.) Schliessen der Lücken mit Sub-Bibliotheken
ca. 50 contigs 3.) Schliessen der Lücken mit genomischen Bibliotheken
13 contigs
2g19 1 1k20 3 2f17bac 5 1p12bac 7 2l11bac 9 1f17bac 11 1h9bac 13 1c15abac 15 3j18 17 2j24bac-g 19 1h5bac 21 1g7bac 23 1d2bac 25 1l24 27 5b5 29 X3l10g 31 3n24 33 1o6p3 35 1o8 37 16f19bac-g 39 1g16bac 41 1b1abac 43 1o16 45 1o13 47 1b17 49 1l9bac 51 2h23bac 53 7k22bac-g 55 1e6bac 57 1o17 59 1o12 61 2c18 63 1i15bac 65 2c19bac 67 6c6 69 1j8 71 1l16bac 73 1a24 75 2a13bac 77 1d16abac 79 1a9g 81 9a16bac-g 83 1k6bac 85 1k15p2 87 1i11bac 89 1k17 91 1n9bac 93 2a13 95 X6l13g 97 2 1o2 4 3a11 6 1b19bac 8 1c2bac 10 1c12 12 1l17 14 1k2 16 1b10 18 1f19bac 20 1i16bac 22 1b12 24 1n8 26 10m7g 28 1i13a 30 1m8 32 7j19bac-g 34 1b1 36 1d12bac 38 1c10 40 1m20bac 42 2c16bac 44 1p23bac 46 1n14bac 48 2g1bac 50 16g14g 52 2g12 54 1h1bac 56 1i5bac 58 6e3 60 1m10 62 1i1bac 64 24n4bac-g 66 1n22 68 1f1bac 70 2h18bac 72 1c16 74 1m24bac 76 2d10 78 1a13bac 80 1n16bac 82 1e8a 84 2e8bac 86 5a24a 88 5o22bac-g 90 G1o19g 92 1e18 94 G4i18g 96 1p15
mus-23
arg-5, aro-3
het-6
ro-7 leu-6
leu-6: Between trp-3 and Tel-IIR
Kartierungsstrategie Chromosom V
Für die physikalische Kartierung von Chromosom V wurden folgende Klon-Bibliotheken verwendet:
Tabelle 3.3: Bibliotheken, die zur physikalischen Kartierung von Chr. V verwendet wurden
Bibliothek Anzahl Klone Beispiel für Klon-benennung Chr.V-Cosmid-Bibliothek
Genomische Cosmid-Bibliothek
1369 19.400
4g12 8c4g
Genomische BAC-Bibliothek 9216 1c16bac-g
Die physikalische Kartierung von Chromosom V wurde zunächst ausschliesslich mit der Chromosom V-spezifischen Cosmid-Bibliothek durchgeführt. Analog zur Kartie-rung von Chromosom II wurden, nachdem alle Klone mindestens in einer Hybridisie-rung ein positives Signal gezeigt hatten, Klone an contig-Enden als Sonden verwendet (Abb. 3.9). Als nach über 1000 Hybridisierungen die sehr grosse Anzahl von über 100 contigs nicht weiter reduziert werden konnte, wurde dazu übergegangen, die Sonden auf die gesamt-genomische Cosmid- und BAC-Bibliothek zu hybridisieren. Dadurch konnte die Zahl der contigs in der physikalischen Karte von Chromosom V letztendlich auf 21 reduziert werden.
Abb. 3.9: Kartierungsstrategie Chromosom V
Insgesamt wurden 1192 Cosmid-Klone und 82 BAC-Klone als Sonden verwendet.
Auch hier wurden die contigs relativ zueinander angeordnet, indem die Reihenfolge von Klonen, die durch Sequenzanalyse identifizierte Gene enthielten, mit der Reihenfolge dieser Genloci in der genetischen Karte (Perkins et al., 2000) verglichen wurde.
1.) „sampling without replacement“
2.) Schliessen der Lücken mit Sub-Bibliotheken
ca. 100 contigs
ca. 40 contigs
genomische BAC-Bibliothek
genomische Cosmid-Bibliothek 3.) Schliessen der Lücken mit genomischen Bibliotheken
21 contigs
Klone
Cosmid-Chr.V-Bibliothek
Cosmid-Chr.V-Bibliothek Hybridisierung
Klone an contig-Rändern (Cosmide)
Cosmid-Chr.V-Bibliothek Hybridisierung
Klone an contig-Rändern (BACs oder Cosmide)
Hybridisierung
Abb. 3.10: Physikalische Karte von Chromosom V. Oberhalb der physikalischen Karte ist die gene-tische Karte (Perkins et al., 2000) gezeigt.
4k13 1 4o12 3 5a1 5 4k23 7 7d19bac 9 5n16 11 3b14 13 6c5 15 4n1 17 2f24 19 4l17 21 7h2 23 5d2 25 1n12 27 3c8 29 3p15 31 3n19 33 7f24 35 1e18 37 1k1a 39 5b13 41 5i2 43 1p19 45 4b24 47 7j14 49 1a23 51 1b10 53 4d2 55 13l16bac 57 1k10 59 5i23 61 7a14 63 4b15 65 5n13 67 6d12 69 3g15bac 71 6b23 73 5k7 75 5e11 77 1b18 79 4h13 81 8k1bac 83 4n1bac 85 3e7 87 7g9 89 7a12 91 6f16 93 4d4 95 5i11 97 5l4bac 99 5k10 101 7b24 103 2a18 105 1f1 107 4m23 109 4h17 111 6c8 113 5f5 115 3h8 117 4a4bac 119 3o6 121 7a4 123 2e24 125 4p6 127 3l1 129 7k9 131 5p20bac 133 1e16 135 1d4 137 1n22 139 2b14 141 10i5bac 143 3l24 145 3n18 147 1f14bac 149 X4i21g 151 6f13 153 4h1bac 155 5k2 157 7i4 159 3o9 161 4f15 163 3b18 165 4a22 167 4l18 169 7c12 171 4b14 173 4f13 175 4l19 177 3d12bac 179 7c8 181 1m16 183 7c21 185 4j3bac 187 5m7 189 5h19 191 4h19bac 193 4o9bac 195 5b7 197 12l8bac 199 2 4f2bac 4 2e12 6 5l4 8 5l5 10 1j24 12 6b15 14 6a5 16 1m20 18 4m1 20 1l16 22 6l18bac 24 3e4 26 1p13 28 4j24 30 1d12 32 7g2 34 3b17 36 4c6 38 1l9 40 4g21 42 6i22bac 44 3c12 46 9j24bac 48 1m7 50 2e13 52 5c5 54 7j6 56 11o15bac 58 2c6 60 1d19 62 3e15 64 4o13 66 8k18bac 68 18a19bac 70 6g2 72 7k24 74 1c3 76 2m19bac 78 8c3bac 80 5j22 82 7j24 84 3n7 86 3n8 88 1b3bac 90 5i18 92 3o2 94 5g6 96 5f13 98 5g21 100 7i1 102 6d23 104 3b23 106 6f8 108 7d17 110 6e21 112 3a11bac 114 5h12 116 1k16 118 6b3 120 6e16 122 3m10 124 7i6 126 6c22 128 1c23 130 1o9 132 2b9 134 4o2bac 136 1k19 138 1o6 140 7f24bac 142 6c23 144 4h4 146 6b20bac 148 3n15bac 150 3a6bac 152 7g23 154 4l4 156 5c11 158 1d11 160 4l4bac 162 3a11 164 7d6 166 7a3 168 4p7 170 3k20 172 4m18 174 5a2 176 10a11bac 178 3n12 180 3o3 182 2d11 184 5i5 186 11g10bac 188 7i19 190 7i16 192 5j10bac 194 8g12bac 196 4c22 198 4n21bac
his-6
ilv-2 mus-18 arg-4
sod-2 al-3 inl acu-3 erg-2
mus-11
trp-5
arg-4: Between sp (1%; 11%) and inl (2%; 4%) erg-2: Left of inl (6%) sod-2: Linked to cyh-2