Physikalische Kartierung und
Genexpressionsanalysen
im Genom von Neurospora crassa
DISSERTATION
zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
an der Universität Konstanz
Mathematisch-Naturwissenschaftliche Sektion Fachbereich Biologie
vorgelegt von
Verena Aign
Tag der mündlichen Prüfung: 21. Februar 2002 Referent: Prof. Dr. R. Knippers
Prof. Dr. R. Knippers, Fachbereich für Biologie der Universität Konstanz, am Deut- schen Krebsforschungszentrum Heidelberg in der Abteilung „Funktionelle Genomana- lyse“ unter der Leitung von Dr. J. D. Hoheisel angefertigt.
Herrn Prof. Dr. Rolf Knippers danke ich herzlich für die Betreuung meiner Promotions- arbeit.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Jörg Hoheisel für die Möglickeit, die Promotion in seiner Abteilung durchführen zu können, für seine stete Diskussionsbereitschaft und seine vielen Lösungsvorschläge bei Fragen, die im Laufe meiner praktischen Arbeit auftraten. Ebenso danke ich ihm für die Ermöglichung eines Forschungsaufenthaltes in USA sowie vieler Kongressbesuche im In- und Ausland.
Besonders herzlich möchte ich mich bedanken bei Mareike Grees für ihre engagierte Mitarbeit vorallem bei der Etablierung und Durchführung der Versuche zu den Genex- pressionsanalysen. Ausserdem danke ich ihr und Sandra Schwarz für viele nette Stun- den im Labor X021 und beim „Chinesen“.
Carmen Fischer danke ich für viele Hybridisierungen zur physikalischen Kartierung.
Für Tips und Tricks bezüglich des physikalischen Kartierens möchte ich mich bei Jens Hanke und Marcus Frohme bedanken, für die hilfreiche Unterstützung beim „expression profiling“ danke ich vorallem Andrea Bauer, Frank Diehl und Boris Beckmann.
Bei Ole Brandt und Boris Beckmann bedanke ich mich für ihre stete Hilfsbereitschaft bei allen geklärten und ungeklärten Fragen rund um UNIX und PC, bei Kurt Fellenberg bedanke ich mich für seine unermüdliche Geduld und seine Einführung in die uner- gründlichen Tiefen von M-Chips.
Ebenso möchte ich mich auch bei allen anderen Mitarbeitern der AG Hoheisel für die angenehme Arbeitsatmosphäre im Container bedanken.
Mein herzlichster Dank gilt Markus für sein grosses Verständnis, seine ausdauernde Geduld und die moralische Unterstützung, die er mir nicht zuletzt durch etliche wissen-
A Abkürzungen
...1B Zusammenfassung
...21. Einleitung
...41.1. Der Modellorganismus Neurospora crassa ...4
1.1.1. Historischer Hintergrund ...4
1.1.2. Lebenszyklus ...5
1.1.3. Das Genom von Neurospora crassa...7
1.1.4. Neurospora crassa Genom-Projekt ...8
1.2. Physikalische Kartierung ...9
1.3. DNA-Chip-Technologie...10
1.4. Genexpressionsanalysen...12
2. Material und Methoden
...162.1. Material ...16
2.1.1. Chemikalien und Biochemikalien ...16
2.1.2. Enzyme...17
2.1.3. DNA-Längenstandards...18
2.1.4. Primer für PCR ...18
2.1.5. Häufig verwendete Puffer, Medien und Lösungen...18
2.1.6. Verwendete Chemikaliensätze...21
2.1.7. Materialien...21
2.1.8. Geräte...22
2.1.9. Bibliotheken...23
2.1.9.1. Genomische Cosmid-Bibliothek...23
2.1.9.2. Genomische BAC-Bibliothek...23
2.1.9.3. cDNA-Bibliothek...24
2.2. Methoden Physikalische Kartierung...25
2.2.1. Anzucht und Replikation von genomischen Bibliotheken...25
2.2.2. Herstellung genomische Cosmid-Bibliothek ...25
2.2.2.1. Präparation genomischer DNA aus Neurospora crassa...25
2.2.2.2. Partialrestriktion genomischer DNA und Dephosphorylierung ...26
2.2.2.3. Ligation der N. crassa-DNA in den Vektor pLawrist-4...27
2.2.2.4. Transfektion ...27
2.2.2.5. Überführung von Klonen in Mikrotiterplatten...27
2.2.3. Herstellung von DNA-Filtern ...28
2.2.4. Selektion Chromosom II- bzw. V spezifischer Cosmid-Bibliotheken...29
2.2.5. Selektion einer Chromosom II-spezifischen BAC-Bibliothek ...30
2.2.6. Präparation von Cosmid-DNA...30
2.2.7. Präparation von BAC-DNA...31
2.2.8. Hybridisierung mit radioaktiv markierter DNA...32
2.2.8.1. Radioaktive Markierung der DNA...32
2.2.8.2. Hybridisierung der radioaktiv markierten Sonden ...32
2.2.8.3. Autoradiographien ...33
2.2.8.4. Regeneration der Filter...33
2.2.9. Hybridisierung mit Digoxigenin-markierter DNA ...33
2.2.9.1. Markierung von DNA mit Digoxigenin ...33
2.2.9.2. Hybridisierung der mit Digoxigenin markierten DNA...33
2.2.9.3. Chemilumineszente Signaldetektion mit CSPD®...34
2.2.9.4. Regeneration der Filter...34
2.2.10. Analyse der Hybridisierungsdaten ...34
2.3. Methoden Genexpressionsanalysen ...36
2.3.1. Anzucht und Replikation der cDNA-Bibliothek ...36
2.3.2. PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek ...36
2.3.3. Herstellung heterologer Kontrollen...37
2.3.4. Herstellung der DNA-Chips ...38
2.3.4.1. Beschichtung von Glas-Objektträgern mit Poly-L-Lysin ...38
2.3.4.2. Aufbringen der DNA auf die Chips ...38
2.3.5. Mycelproben von Neurospora crassa ...40
2.3.6. Isolierung von RNA aus Neurospora crassa ...40
2.3.7. Markierung von komplexen Proben durch cDNA-Erststrangsynthese ...41
2.3.7.1. Reverse Transkription unter Verwendung von aa-dUTP...41
2.3.7.2. Kupplung von reaktiven Fluoreszenzfarbstoff-Estern an aa-dUTP...42
2.3.7.3. Photometrische Einbaubestimmung von Cy3/Cy5...42
2.3.8. Hybridisierung auf Glas-Chips ...43
2.3.9. Auswertung der Hybridisierungsdaten ...45
2.3.9.1. Detektion...45
2.3.9.2. Quantifizierung der Signalintensitäten mit GenePix™ ...45
2.3.9.3. Datenanalyse mit M-Chips...45
3. Ergebnisse
...493.1. Physikalische Kartierung ...49
3.1.1. Herstellung der gesamt-genomischen Cosmid-Bibliothek...49
3.1.2. Selektion chromosomenspezifischer Cosmid-Bibliotheken...52
3.1.3. Selektion Chromosom II-spezifische BAC-Bibliothek...54
3.1.6. Physikalische Kartierung...57
3.1.7. Sequenzanalyse ...65
3.2. Genexpressionsanalysen...69
3.2.1. PCR-Amplifikation der cDNA-Bibliothek ...69
3.2.2. Herstellung heterologer Kontrollen...70
3.2.3. Herstellung der DNA-Chips ...71
3.2.4. Isolierung von RNA aus Neurospora crassa ...72
3.2.5. Generierung der Hybridisierungsdaten...72
3.2.6. Datenanalyse mit M-Chips ...74
3.2.7. Vergleich der Transkriptionsprofile von N. crassa mit S. cerevisisae...76
3.2.8. Genexpression von N.crassa bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien...78
4. Diskussion
...904.1. Das Neurospora crassa Genom-Projekt ...91
4.2. Physikalische Kartierung ...92
4.2.1. Verwendete Bibliotheken ...92
4.2.2. Selektion von Sub-Bibliotheken ...95
4.2.3. Präparation von BAC-DNA...96
4.2.4. Hybridisierungstechniken...97
4.2.5. Kartierungsstrategie Chromosom V ...98
4.2.6. Kartierungsstrategie Chromosom II ...100
4.3. Genexpressionsanalysen...101
4.3.1. DNA-Chip-Technologie ...101
4.3.2. Verwendete cDNA-Bibliothek...102
4.3.3. Amplifikation der cDNA-Bibliothek...103
4.3.4. Markierungsreaktion ...103
4.3.5. Hybridisierung ...105
4.3.6. Genexpression von N.crassa bei Wachstum in verschiedenen Nährmedien...106
4.4. Ausblick...110
5. Literaturverzeichnis
...1126. Eigene Publikationen
...1217. Lebenslauf
...122A) Abkürzungsverzeichnis
aa-dUTP Aminoallyl-2´-Desoxyuridin-5´-triphosphat ATP Adenosin-5´-triphosphat
BAC bacterial artificial chromosome
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin (bovine serume albumine) cDNA komplementäre DNA (complementary DNA)
CSPD 3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetan-3,2´-(5´chloro)tricyclo[3.3.1.1.3,7]decan}-4-yl Phenylphosphat dATP 2´-Desoxyadenosin-5´-triphosphat
dCTP 2´-Desoxycytidin-5´-triphosphat
DEPC Diethylpyrocarbonat
dGTP 2´-Desoxyguanosin-5´-triphosphat
DIG-11-dUTP Digoxigenin-11-2´-desoxyuridin-5´-triphosphat
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid ) dNTP 2´-Desoxyribonukleosid-5´-triphosphat
DTT Dithiothreitol
dTTP 2´-Desoxythymidin-5´-triphosphat dUTP 2´-Desoxyuridin-5´-triphosphat E. coli Escerichia coli
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure FGSC Fungal Genetic Stock Center
g Gramm
h Stunde
kb Kilobasenpaare (= 1000 )
l Liter
M Molar
m~ milli (10-3)
Mb Megabasenpaare (=1.000.000 )
min Minute
mRNA kodierende RNA (messenger RNA)
n~ nano (10-9)
ORF offener Leserahmen (open reading frame)
PCR Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction) RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)
SDS Natriumdodecylsulfat
Tris Tris (hydroxymethyl)-aminomethan
tRNA Transfer-RNA
U Einheit (Unit)
B) Zusammenfassung
Der filamentöse Ascomycet Neurospora crassa dient seit mehr als 50 Jahren als Mo- dellorganismus vor allem für genetische Studien. Um das bisher erlangte Wissen, das in mehr als 5000 Veröffentlichungen publiziert wurde, für das gesamte Genom zu kom- plettieren und um daraus tiefere Einblicke in die Biologie von Pilzen gewinnen zu kön- nen, wurde eine Genom-Initiative ins Leben gerufen, deren erstes Ziel die vollständige Sequenzierung von N. crassa ist. Das deutsche Neurospora crassa Genom-Projekt, dass 1998 initiiert wurde, machte es sich zur Aufgabe, die Chromosomen II und V, die zu- sammen etwa ein Drittel der Gesamtsequenz ausmachen, zu sequenzieren.
Die im ersten Teil dieser Arbeit erstellten physikalischen Klonkarten von Chromosom II und V dienten als Basis für die Sequenzierung. Für die Kartierung wurde zunächst eine genomische Cosmid-Bibliothek hergestellt, zu der eine bereits bestehende Cosmid- Bibliothek hinzugefügt wurde, so dass man insgesamt eine 17-fache Abdeckung des Genoms auf Cosmid-Ebene erreichte. Weiterhin wurde eine genomische BAC- Bibliothek mit einer 15-fachen statistischen Abdeckung zur Verfügung gestellt. Aus diesen Bibliotheken wurden zunächst Chromosomen-spezifische Sub-Bibliotheken se- lektiert. Dazu wurden die Klone der genomischen Bibliotheken in einem hochdichten Raster auf Nylonmembranen angeordnet. Die Selektion der Cosmid-Sub-Bibliotheken erfolgte durch Hybridisierung radioaktiv markierter chromosomaler DNA auf die Mem- branen mit der genomischen Cosmid-Bibliothek. Im Falle der BAC-Sub-Bibliothek wurden Chromosom-spezifische Cosmide auf die Membranen mit der genomischen BAC-Bibliothek hybridisiert. Die bei diesen Hybridisierungen positiven BAC-Klone wurden als Chromosom-spezifisch identifiziert und selektiert.
Ausgehend von den Sub-Bibliotheken wurde die physikalische Kartierung durch Hybri- disierung begonnen. Die DNA einzelner Klone wurde nach Markierung auf die Mem- branen der Sub-Bibliotheken hybridisiert, wodurch benachbarte Klone identifiziert wer- den konnten. Die Anordnung der Klone anhand ihrer Hybridisierungsmuster zu einer physikalischen Karte erfolgte mit einem Softwarepaket. Um Lücken in den Karten schliessen zu können, wurden in der Endphase die Hybridisierungen auf die Membra- nen mit den genomischen Bibliotheken durchgeführt. Die resultierende Karte von Chromosom II besteht aus 13, die Karte von Chromosom V aus 21 Bereichen zusam- menhängender Klone. Basierend auf diesen physikalischen Klonkarten wurde die Se- quenzierung der beiden Chromosomen begonnen.
Im zweiten Teil der Arbeit wurden Genexpressionsanalysen mit Hilfe der DNA-Chip- Technologie durchgeführt. Die klonierten Fragmente einer zur Verfügung gestellten cDNA-Bibliothek, die 4700 Klone enthielt, wurden mittels PCR amplifiziert und in ei- nem hochdichten Raster auf Glas-Chips aufgebracht. Durch Hybridisierung komplexer RNA-Proben wurden die Transkriptionsprofile für drei verschiedene Wachstumsbedin- gungen für Mycel von N. crassa erstellt. Zwei Mycel-Proben waren auf Minimalmedi- um gewachsen, wobei bei einer Probe als Kohlenstoff-Quelle im Minimalmedium Sac- charose enthalten war, bei der zweiten Probe stattdessen Natriumacetat. Die dritte Probe war auf sogenanntem Vollmedium gewachsen, dass ausser Saccharose zusätzlich Hefe- Extrakt und Caseinhydrolysat enthielt. Für den Vergleich der Genexpression wurden jeweils zwei mRNA-Populationen nach Markierung durch reverse Transkription mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen auf die Chips cohybridisiert. Nach Detektion und Quantifizierung der Signalintensitäten, die direkt mit der Häufigkeit des entspre- chenden Transkripts korrelieren, wurden aus dem Verhältnis der Signalintensitäten bei- der Proben Faktoren für Induktion bzw. Repression der zugehörigen Gene bestimmt.
Die bioinformatische Datenanalyse erfolgte mit einem eigens in der Arbeitsgruppe für Genexpressionsanalysen auf DNA-Chips entwickelten Programm. Neben der Normali- sierung der Daten wurde mit dem Programm die Durchführung einer Korrespondenza- nalyse ermöglicht. Mit dieser Methode wurden die Transkriptionsprofile der drei zu vergleichenden Proben analysiert und in einem anschaulichen Diagramm visualisiert.
Es konnte gezeigt werden, dass bei Proben, die auf Minimalmedium gewachsen sind, mehr Stoffwechselwege aktiviert sind als bei Wachstum auf einem nährstoffreichen Vollmedium. Bei Wachstum auf Acetat-haltigem Medium sind ebenfalls mehr Stoff- wechselwege induziert, wenn auch vergleichsweise schwächer als in Minimalmedium.
Da Acetat eine unzureichende Nährstoffquelle für N. crassa ist, ist die Stoffwechselak- tivität insgesamt geringer.
1. Einleitung
1.1. Der Modellorganismus Neurospora crassa
1.1.1. Historischer Hintergrund
Der filamentöse Pilz Neurospora crassa wurde bekannt, als mit der „Ein-Gen-ein- Enzym“-Hypothese (Beadle, 1945) die erste Verbindung zwischen Genen und ihrer biochemischen Funktion hergestellt wurde. Entdeckt wurde er bereits ein Jahrhundert früher, als im warmen und feuchten Sommer von 1842 Brot aus den Bäckereien von Paris mit einem orangen Pilz bedeckt war. Seinen heutigen Namen bekam er 1927 von Shear und Dodge (Shear & Dodge, 1927). Seit über 50 Jahren gilt er als Modellorga- nismus, bedingt einerseits durch sein schnelles Wachstum, seine kurze Replikationszeit und seine hohe Fruchtbarkeit, durch die er routinemässig und unkompliziert im Labor kultiviert werden kann, aber auch durch andere Vorteile wie eine geringe Chromoso- menzahl, cytologisch leicht zugängliche Produkte der Meiose oder seine fehlende Pa- thogenität. Seither wurden zahlreiche genetische und biochemische Studien an Neu- rospora durchgeführt, die in über 5000 Veröffentlichungen festgehalten wurden. So wurden beispielsweise mit Neurospora die ersten biochemischen Mutanten isoliert (Beadle & Tatum 1941) und grundlegende Erkenntnisse über die Rekombination (Mit- chell, 1955; Catcheside et al., 1964) erhalten. Bis heute wurden über 1000 Gen-Loci charakterisiert und auf den sieben Chromosomen kartiert (Perkins et al., 2000). Im Fun- gal Genetic Stock Center (http://www.fgsc.net/) in Kansas, USA, werden mehr als 8000 verschiedene Neurospora-Stämme und -Mutanten gelagert und verwaltet. Gerade in den letzten Jahren diente Neurospora als einer der führenden Organismen zur Untersuchung von Photobiologie (Lauter, 1996) und zirkadianem Rhythmus (Bell-Pedersen, 2000;
Dunlap, 1999).
1.1.2. Lebenszyklus
Der Lebenszyklus von Neurospora crassa (Davis, 2000) teilt sich in zwei Stadien auf, die Haplophase und die Diplophase (siehe Abb.1.1).
Während der Haplophase bilden sich die fadenförmigen Mycelien aus, die vielkernig
sind. Das Mycel verzweigt sich in einzelne Hyphen, aus denen durch Abschnürung die haploiden Macroconidien gebildet werden, die eine intensive orange Farbe haben.
Macroconidien haben einen bis mehrere, am häufigsten jedoch zwei Zellkerne. Die Macroconidien können bei geeigneten Wachstumsbedingungen wiederum zu Mycelien auskeimen. Durch einen hydrophoben Protein-Mantel werden die Macroconidien vor Feuchtigkeit geschützt, wodurch sie schon durch leichte Luftbewegungen weiträumig verteilt werden können. Daraus kann eine sehr rasche Kolonisierung neuer Bereiche durch N. crassa resultieren.
Abb. 1.1: Lebenszyklus von N. crassa (Davis, 2000)
Vereinzelt werden während der Haplophase auch einkernige Microconidien gebildet.
Mitose, Bildung der Ascosporen Ascosporen-
Mikrokolonie
keimende
Ascospore Vegetative Hyphen
Ascus mit Ascosporen
Meiose II
Meiose I
Zellkern- Fusion Konjugierte Teilung
Ascogoniale Hyphen
Diplophase Haplophase,
Bildung der Macroconidien
Conidium des entgegengesetzten Paarungstyps
Ascogonium Ascogonium-Zellkern befruchtender Kern
N. crassa als heterothallischer Organismus bildet Mycelien zweier verschiedener Paa- rungstypen aus, Typ a und Typ A. Der Eintritt in die Diplophase erfolgt, wenn Conidien des einen Paarungstyps auf Mycel des anderen Paarungstyps treffen. Bei dem als weib- lichen Elternteil dienenden Mycel, das sowohl Typ a als auch Typ A sein kann, hat sich zuvor ein mehrzelliges Protoperithecium ausgebildet. Dieses besteht aus einem Knoten von Hyphen, die mehrere spezielle Zellen, die Ascogonien, umgeben. Eine der Ascogo- nien dient als weibliche Keimzelle. Die umliegenden Hyphen bilden eine dichte Schutz- schicht, durch die, ausgehend von der Keimzelle, eine oder mehrere filamentöse Trichogynen ragt. Diese Trichogyne wächst Pheromon-gesteuert auf ein Conidium des entgegengesetzten Paarungstyps zu, bis es zu Kontakt und Zellfusion kommt. Der Zell- kern des Conidiums wandert nun durch die Trichgyne zum Ascogonium im Inneren des Protoperitheciums. In dem sich nun vergrössernden Perithecium kommt es zunächst zu mehreren synchronen mitotischen Teilungen, bevor es durch Verschmelzung von Zell- kernen entgegengesetzten Paarungstyps zur Ausbildung mehrerer Zygoten kommt. Die Zygoten befinden sich in sich allmählich ausformenden sackartigen Gebilden, den Asci.
Hier durchlaufen sie zwei meiotische Teilungen mit einer sich anschliessenden mitoti- schen Teilung, so dass jeder Ascus acht Zellkerne, die Ascosporen, enthält. Die Ascos- poren sind von einer harten, melanisierten Zellwand umgeben. In einem Perithecium können 200-400 Asci enthalten sein. Die Perithecien sind zum Schutz ebenfalls mit ei- ner melanisierten harten Wand umgeben. Unter geeigneten Bedingungen wie z.B. Hit- zeschock brechen die Asci auf und entlassen die haploiden Ascosporen. Mit dem Kei- men der Ascosporen zu Mycelien beginnt erneut die Haplophase des Lebenszyklus.
1.1.3. Das Genom von Neurospora crassa
Der Modellorganismus Neurospora crassa gehört zu den filamentösen Ascomyceten, auch Schlauchpilze genannt.
Überreich: Eukaryoten Reich: Pilze
Stamm: Ascomyceta
Unterstamm: Pezizomycotina Klasse: Sordariamycetes
Ordnung: Sordariales Familie: Sordariaceae
Gattung: Neurospora Art: crassa
Das Genom von N. crassa hat eine Länge von ca. 43 Mb. Der Chromosomensatz ist haploid, es gibt sieben Chromosomen, von denen das kleinste 4,0 Mb und das grösste 10,3 Mb umfasst (Orbach et al., 1988). Die DNA hat einen GC-Gehalt von durch- schnittlich 54%, in codierenden Bereichen kann der GC-Gehalt bis zu 64% betragen.
Das Genom beinhaltet etwa 8% repetitive Sequenzen, die meisten davon codieren für ribosomale RNA oder tRNA (Radford & Parish, 1997). Die Gesamtzahl der Gene von Neurospora crassa wurde auf 10-12.000 geschätzt (Nelson et al., 1997; Kelkar et al., 2001). Das Genom von N. crassa ist im Vergleich zum Genom von Saccharomyces cerevisiae (Goffeau et al., 1997), ebenfalls ein Ascomycet und erster vollständig se- quenzierter eukaryotischer Organismus, dreimal so gross und besitzt schätzungsweise 1,5 bis 2,2 mal so viele Gene (Braun et al., 2000).
1.1.4. Neurospora crassa Genom-Projekt
Im Jahr 1997 wurde eine internationale Genom-Initiative ins Leben gerufen (Bennett, 1997), deren erstes grosses Ziel die Sequenzierung des Modellorganismus N. crassa ist.
Durch die Entschlüsselung der Sequenz von N. crassa soll die Grundlage geschaffen werden, um mehr Erkenntnisse über die Biologie von Pilzen zu gewinnen. Denn obwohl N. crassa selbst keine industrielle und wirtschaftliche Bedeutung hat, ist er phylogene- tisch sehr nah verwandt mit einigen Pflanzenpathogenen wie Cochliobolus, dem Erreger von Braunfleckenkrankheit bei Mais, dem weitverbreiteten, u.a. Wurzel- und Stengel- fäulnis verursachenden Fusarium oder dem Reisbranderreger Magnaporthe grisea.
Durch eine detailierte Sequenzanalyse von N. crassa erhofft man sich, Rückschlüsse auf diese weniger gut untersuchten Pflanzenpathogene ziehen zu können. Weiterhin soll mit der Sequenzierung der Grundstein gelegt werden für eine intensive Untersuchung von Transkriptom und Proteom von N crassa. Dem Genom-Projekt kommt zugute, dass N. crassa ein bislang schon sehr detailiert untersuchter Organismus ist. Die Grösse des Genoms sowie die Anzahl und Grösse der einzelnen Chromosomen sind bekannt, eben- so wie die Loci von mehr als 1000 Genen (Perkins et al., 2000).
Das deutsche Neurospora crassa Genom-Projekt, gefördert von der Deutschen For- schungsgemeinschaft (DFG), wurde 1998 initiiert. Sein Ziel war es, Chromosom II mit einer Grösse von 4,6 Mb und Chromosom V mit einer Grösse von 9,2 Mb zu sequenzie-
zieren Klone ausgewählt, die eine möglichst minimale Überlappung aufweisen, wo- durch die Redundanz der erzeugten Sequenzdaten deutlich reduziert werden konnte.
Dieses Vorgehen wurde bereits in früheren Sequenzierungs-Projekten erfolgreich an- gewandt (Schizosaccharomyces pombe : Hoheisel et al., 1993, Saccharomyces cerevi- siae, Chromosom XII : Scholler et al., 1995).
Die Sequenzierung wurde bei MWG Biotech AG (Ebersberg) durchgeführt, bei MIPS (Martinsried Institute for Protein Sequences, München) wurden die Sequenzdaten zu- sammengeführt, annotiert und in einer Datenbank veröffentlicht (Mewes et al., 2000;
MNCDB : "MIPS Neurospora crassa database", http://www.mips.biochem.mpg.de/proj /neurospora/ ). Zum gegenwärtigen Zeitpunkt liegen von Chromosom II 3,5 Mb anno- tierte Sequenzdaten vor, was ca. 76% von Chromosom II entspricht. Es bestehen noch 12 Lücken, ca. 1 Mb des Chromosoms konnte noch nicht erfasst werden. Von Chromo- som V wurden bisher 4,2 Mb sequenziert und annotiert, was ca. 46% des Chromosoms entspricht. Hier gibt es noch 14 Lücken, es fehlen an Sequenz noch 5 Mb, von denen ca. 2 Mb ein hoch-repetetives rRNA-Gencluster beinhalten, das nicht sequenziert wer- den soll.
Die restlichen Chromosomen sollten in einer Kollaboration mit dem amerikanischen
"Neurospora Genome Project" sequenziert werden. Inzwischen wurde jedoch das ge- samte Genom im sogenannten "Whole Genome Shotgun"-Verfahren, also ohne vorheri- ges Kartieren der einzelnen Chromosomen, vom Whitehead Institute Center for Genome Research (WICGR, Massachusetts, USA) sequenziert. Innerhalb eines halben Jahres wurden hier knapp über 38 Mb sequenziert und ebenfalls in einer Datenbank öffentlich zugänglich gemacht (WICGR Neurospora Database, http://www- genome.wi.mit.edu/annotation/fungi/neurospora/). Der Abschluss der Sequenzierung und die vollständige Annotation des gesamten Genoms sollen bis Januar 2002 durchge- führt werden.
1.2. Physikalische Kartierung
Am Anfang fast aller Genomprojekte steht die Sequenzierung des zu untersuchenden Genoms. Da auch moderne Sequenziergeräte nur DNA-Stücke bis zu 1 kb Länge am Stück sequenzieren können, muss die genomische DNA zunächst fragmentiert werden.
Die Fragmente werden je nach Grösse in entsprechende Vektoren kloniert und anschlie-
ssend sequenziert. Die Erstellung einer physikalischen Karte hilft dabei, die Redundanz der erzeugten Sequenzdaten zu verringern, da sie eine geordnete, lineare Anordnung der Fragmente darstellt, aus denen dann zum Sequenzieren diejenigen ausgesucht werden können, die eine minimale Überlappung aufweisen. Dem gegenüber steht der soge- nannte "shotgun"-Sequenzierungsansatz, bei dem zufällig ausgewählte Fragmente se- quenziert werden, die erst nachträglich mit erheblichem Rechenaufwand zur vollständi- gen Sequenz angeordnet werden. Durch die rein zufällige Auswahl der zu sequenzie- renden Fragmente wird ein hoher Überschuss an redundanten Daten erzeugt.
Für das Erstellen von physikalischen Karten gibt es im Wesentlichen zwei verschiedene Methoden:
Bei der älteren Restriktionskartierung werden überlappende Fragmente nach Restrikti- onshydrolyse und Analyse durch Gelelektrophorese aufgrund der entstandenen Ban- denmuster identifiziert und geordnet (Coulson et al. 1986). Bei der physikalischen Kar- tierung durch Hybridisierung, die im Rahmen dieser Arbeit angewendet wurde, werden überlappende Klone aufgrund ihrer Hybridisierungsmuster angeordnet und zu "contigs"
(von engl. contigous = benachbart; zusammenhängende Bereiche überlappender Frag- mente) zusammengefasst (Hoheisel et al., 1993; Scholler et al., 1995). Dazu werden die zu ordnenden Fragmente in einem definierten Raster auf eine Membran aufgebracht.
Als Hybridisierungssonden können die Fragmente selbst, aber auch Oligonukleotide (Craig et. al., 1990), genetische Marker oder Klone aus anderen Bibliotheken (Hoheisel
& Lehrach, 1993, Aign et al., 2001) dienen. Die Auswahl der Sonden erfolgt zunächst nach dem als "sampling without replacement" bezeichneten Verfahren (Press et al., 1988), bei dem nur solche Klone als Sonden ausgewählt werden, die in den vorange- gangenen Hybridisierungen noch kein positives Hybridisierungssignal erzeugt haben.
Später werden zum Schliessen der Lücken diejenigen Klone als Sonde ausgewählt, die an contig-Enden liegen, um bestehende contigs zu verlängern oder gar mit anderen con- tigs verbinden zu können.
1.3. DNA-Chip-Technologie
Die DNA-Chips werden je nach Trägermaterial, Art der Nukleinsäuremoleküle und Mechanismus der Immobilisierung unterschieden in "macroarrays", "microarrays" und
"oligo-arrays" (Granjeaud et al., 1999; DeRisi & Iyer, 1999). Die Terminologie für die DNA-Chip-Technologie wurde dahingehend definiert, dass die auf dem Chip immobili- sierte DNA als Sonde bezeichnet wird, auf die die Probe in Form von markierter DNA oder RNA hybridisiert wird ("The Chipping Forecast", 1999).
In Anlehnung an die von Southern (1975) entwickelten Hybridisierungstechniken be- stehen macroarrays aus flexiblen Membranen wie Nitrocellulose, Nylon oder Polypro- pylen, auf die durch mechanische Dispensierung die Sonden in Form von PCR- Produkten, Plasmid-Klonen oder langen Oligonukleotiden (50-70 bp) (Kane et al., 2000) aufgebracht werden. Zu den macroarrays gehören deshalb auch die für die physi- kalische Kartierung durch Hybridisierung verwendeten Klonfilter. Die Bindung der DNA erfolgt elektrostatisch über die positiv geladene Oberfläche der Membranen.
Durch das poröse Trägermaterial und die dadurch erforderliche grössere Menge an Son- denmaterial können Raster mit einer Dichte von nicht mehr als 100 Sonden pro cm2 erstellt werden, bei einer Membrangrösse von 22x22 cm entspricht dies ca. 36.000 Son- denpunkten. Die Hybridisierung muss durch die Grösse und die Porösität der Membra- nen in relativ grossen Volumina von bis zu 20 ml stattfinden, wodurch die zu hybridi- sierende Probe stark verdünnt wird. Die Proben sind meist radioaktiv markiert, in selte- nen Fällen auch chemilumineszent.
Für die Herstellung von microarrays werden feste Trägermaterialien, meist Glas, ver- wendet. Auch hier werden meist PCR-Produkte, seltener auch Plasmid-Klone oder lan- ge Oligonukleotide mit Hilfe von Robotern mechanisch in einem definierten, hoch- dichten Raster aufgebracht. Die Glasoberfläche ist derart modifiziert, dass die Nuklein- säuremoleküle entweder kovalent gebunden werden oder nicht-kovalent durch La- dungswechselwirkungen an der Oberfläche haften. Für diese nicht-poröse Trägermatrix sind im Gegensatz zu den porösen Membranen der macroarrays geringere Mengen an Sondenmaterial erforderlich. Dadurch und durch die Verwendung von Fluoreszenz- markierten Hybridisierungsproben, die mit hochauflösenden CCD-Kameras oder konfo- calen Lasermikroskopen detektiert werden können, wurde eine Miniaturisierung der microarrays gegenüber den macroarrays erreicht. Die Raster der microarrays können eine Dichte von bis zu 2000 Sondenpunkten pro cm2 erreichen. Die Grösse der verwen-
deten Glas-Chips beträgt üblicherweise 25x75 mm. Die Hybridisierung kann daher in sehr kleinen Volumina von 10-40 µl durchgeführt werden, meist unter einem Deckglas, wodurch eine hohe Probenkonzentration und somit eine verstärkte Sensitivität erreicht wird.
Die sogenannten oligoarrays sind eine Untergruppe der microarrays und unterscheiden sich von diesen dadurch, dass die Sonden in Form von kurzen Oligonukleotiden in situ auf der Chip-Oberfläche, die meistens aus Glas besteht, synthetisiert werden. Die Syn- these erfolgt photolithographisch oder nasschemisch, wobei die Oligonukleotide schrittweise um jeweils ein Nukleotid verlängert werden (Fodor et al., 1991; Maskos und Southern, 1992; Lipshutz et al., 1999). Die höchsten Rasterdichten werden zur Zeit durch photolithographische Verfahren erreicht. So werden beispielsweise bei Affyme- trix Raster mit einer Dichte von bis zu 400.000 Oligonukleotiden auf einer Fläche von 1,6 cm2 synthetisiert (Schena et al., 1998; http://www.affymetrix.com). Da jeder Syn- theseschritt eine Ausbeute von nur ca. 95% hat, werden vorzugsweise Oligonukleotide synthetisiert, die maximal eine Basenlänge von 20-30 bp haben, da bei längeren Oligo- nukleotiden die Rate unvollständiger Sequenzen zu stark ansteigen würde. Da bei die- sen kurzen Oligonukleotiden die Spezifität für ein Gen nicht immer gewährleiset ist, werden meist mehrere verschiedene Oligonukleotide für ein Gen ausgewählt, die das Gen über seine Länge hinweg abdecken. Ausserdem wird zur besseren Differenzierung von unspezifischen Kreuzhybridisierungen zu jedem der Sequenz exakt entsprechenden Oligonukleotid („perfect match“) ein zweites Oligonukleotid synthetisiert, das in der Mittelposition ein sequenzfremdes Nukleotid enthält („mismatch“). Die oligoarrays werden ausser für Genexpressionsanalysen vorallem auch für die Detektion von SNPs (single nucleotide polymorphism) eingesetzt.
1.4. Genexpressionsanalysen
Die Untersuchung von Genexpression mit Hilfe der DNA-Chip-Technologie basiert auf der Hybridisierung von mRNA auf ein hochdichtes Raster von immobilisierten Nu- kleinsäuremolekülen, die mit den Sequenzen der zu untersuchenden Gene korrelieren.
Im Gegensatz zu älteren Techniken wie dem "Northern Blot", bei dem nur einzelne Ge- ne analysiert werden können, ist es mit der DNA-Chip-Technologie möglich, die Genexpression von mehreren tausend Genen gleichzeitig zu untersuchen (Brown &
Botstein, 1999; Lockhart & Winzeler, 2000).
Die für Genexpressionsanalysen verwendeten DNA-Chips basieren häufig auf cDNA- Bibliotheken. Mittels PCR werden die klonierten cDNA-Fragmente amplifiziert, die PCR-Produkte werden anschliessend auf Chips aufgebracht. Alternativ werden auch oligoarrays mit bis zu 25 bp langen Oligonukleotiden verwendet, seltener sind micro- arrays im Einsatz, auf die synthetisierte Oligonukleotide mit einer Länge von 50-70 bp aufgebracht wurden. Ein Vorteil in der Verwendung von cDNA-Bibliotheken für Genexpressionsanalysen liegt darin, dass weder die Sequenz des zu untersuchenden Genoms, noch nähere Informationen über einzelne Gene bekannt sein müssen. Dadurch ist es aber nicht möglich, zwischen eventuell vorhandenen Spleiss-Varianten einzelner Gene zu differenzieren. Ist die Sequenz des Genoms bekannt, können gezielt Primer- Paare für eine Amplifikation oder lange Oligonukleotide ausgewählt werden, mit denen ganz spezielle Fragestellungen beantwortet werden können. Auch bei der Verwendung oligoarrays muss die Sequenz des zu analysierenden Genoms bekannt sein.
Für die Hybridisierung wird die RNA als komplexe Probe markiert, sie enthält also jede in dem zu untersuchenden biologischen Material vorhandene mRNA-Spezies entspre- chend ihrer Transkriptmenge. Je höher die Expression eines Gens ist, desto grösser ist sein Anteil in der markierten RNA und desto stärker ist das zugehörige Hybridisie- rungssignal (Freeman et al., 2000; Schena et al., 1995). Werden für die Markierung zweier Proben unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe verwendet, die aufgrund ihrer Exzitations- und Emissionsspektren unabhängig voneinander detektiert werden können, ist die kompetitive Hybridisierung dieser beiden Proben möglich. Dazu werden die zu vergleichenden Zellzustände, respektive deren mRNA-Populationen, mit unterschiedli- chen Fluoreszenzfarbstoffen markiert und parallel auf einen Chip hybridisiert. Diese zwei Zellzustände können somit in einer einzelnen Hybridisierung direkt quantitativ miteinander verglichen werden.
Abb. 1.3: Genexpressionsanalysen mittels DNA-Chip-Technologie (Duggan et al., 1999). A) Zwei zu vergleichende RNA-Proben werden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen mar- kiert und gemeinsam auf einen Chip cohybridisert. B) Nach sukzessiver Anregung und Detektion der beiden Farbstoffe werden die erhaltenen Bilder als Falschfarbendarstel- lung übereinandergelegt.
Bei radioaktiver Markierung der Proben können die Hybridisierungen der verschiede- nen Proben nur einzeln erfolgen, die Signalintensitäten müssen dann von Chip zu Chip verglichen werden.
In beiden Fällen schliesst sich an die Detektion und Quantifizierung der durch die Hy- bridisierung erhaltenen Signalintensitäten eine ausführliche bioinformatische Datena- nalyse an (Schuchhardt et al., 2000; Schadt et al., 2000; Tseng et al., 2001). Dabei wer- den die Daten zunächst normalisiert, um Hybridisierungen direkt miteinander ver- gleichbar zu machen. Unterschiede zwischen einzelnen Hybridisierungen, die eine Normalisierung erforderlich machen, können hervorgerufen werden durch ungleiche Ausgangsmengen von RNA oder cDNA, abweichende Effizienz der Markierungsreakti- on, Unterschiede in der Hybridisierungseffizienz oder dem abweichenden Verhalten der beiden Fluoreszenzfarbstoffe bei Markierung und Detektion. Da die Experimente zur statistischen Validierung der Ergebnisse meist mehrmals wiederholt werden (Lee et al., 2000), muss auch bei kompetitiven Hybridisierungen nicht nur eine Normalisierung innerhalb des Chips erfolgen, sondern auch zwischen verschiedenen Chips.
Wird in einem Experiment nur ein Zellzustand mit einem Kontrollzustand verglichen,
Exzitation
Laser 2 Laser 1
Emission
Datenanalyse Darstellung in
Falschfarben
Kombination der Falschfarbenbilder
cDNA-Bibliothek Referenz
PCR- Amplifikation
Hybridisierung der Probe auf den Chip RNA
Spotten auf Glas
Reverse Transkription
Markierung Fluoreszenzmit Test
A) B)
stem dargestellt werden (Beißbarth et al., 2000). Die normalisierten Signalintensitäten des einen Zellzustands werden gegen die normalisierten Signalintensitäten des Kon- trollzustands aufgetragen (Abb. 1.4). Der Faktor für Induktion bzw. Repression eines Gens ergibt sich, indem die Signalintensitäten beider Bedingungen für dieses Gen ins Verhältnis gesetzt werden (DeRisi et al., 1996; Chen et al.,1997). Gene, die unter bei- den Bedingungen gleich stark exprimiert werden, liegen in dem Koordinatensystem entlang der Winkelhalbierenden mit der Steigung eins. Gene, die in dem zu untersu- chenden Zellzustand stärker exprimiert werden als unter der Kontrollbedingung, liegen oberhalb, Gene, die schwächer exprimiert werden, liegen unterhalb dieser Diagonale.
Abb. 1.4: Darstellung der Genexpression zweier zu vergleichender RNA-Proben im Diagramm
In dieser Arbeit wurde zur Normalisierung und Datenanalyse die Software M-Chips (Fellenberg et al., eingereicht) verwendet, die eigens für diesen Zweck entwickelt wur- de. Ein Bestandteil dieser Software ist die Korrespondenzanalyse (Greenacre, 1984).
Mit diesem Algorithmus, der seinen Ursprung in der Soziologie hat und nun speziell auf die Datenanalyse von Genexpressionsstudien mittels DNA-Chiptechnologie angepasst wurde, werden die Gene als Vektoren in einem multidimensionalen Raum dargestellt.
Die Anzahl der Dimensionen entspricht der Anzahl der untersuchten Bedingungen.
Ebenso wird jede Bedingung in einem multidimensionalen Raum dargestellt. Hier ergibt sich die Anzahl der Dimensionen aus der Anzahl der untersuchten Gene. Beide Räume werden anschliessend mit minimalem Informationsverlust kombiniert auf eine einzelne
Signalintensitäten Kontrolle
Gene, die im untersuchten Zellzustand gleich stark exprimiert werden wie im Kontrollzustand
Gene, die im untersuchten Zellzustand stärker exprimiert werden als im Kontroll- zustand
Gene, die im untersuchten Zellzustand schwächer exprimiert werden als im Kontrollzustand
Signalintensitäten Zellzustand 1
zweidimensionale Ebene projeziert. Induktion bzw. Repression der Gene kann nun di- rekt aus ihrer Lage in der Ebene abgelesen werden. Gene, die im Diagramm dicht bei- einander liegen, verhalten sich unter den untersuchten Bedingungen gleich oder sehr ähnlich (Fellenberg et al., 2001).
2. Material und Methoden
2.1. Material
2.1.1. Chemikalien und Biochemikalien
Allgemeine Laborchemikalien Merck, Darmstadt (Reinheitsgrad: pro analysii
oder höchst möglich) Sigma, Deisenhofen Serva, Heidelberg Fluka, Neu-Ulm Roth, Karlsruhe
[α-32P]-dCTP Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg
Adenosin-5´-triphosphat Roche Diagnostics, Mannheim
Agarose Life Technologies, Karlsruhe
Aminoallyl-dUTP Sigma, Deisenhofen
Ampicillin Serva, Heidelberg
Bacto Agar Difco, Detroit, MI, USA
Bacto Tryptone Difco, Detroit, MI, USA
Bacto Yeast Extract Difco, Detroit, MI, USA Bernsteinsäureanhydrid Fluka, Neu-Ulm
Betain Sigma, Deisenhofen
Blockierungsreagenz Roche Diagnostics, Mannheim
CSPD Roche Diagnostics, Mannheim
Cy3-monoreaktiver Ester Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg Cy5-monoreaktiver Ester Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg
DEPC Roth, Karlsruhe
Desoxy-Ribonukleotid-5´-Triphosphate Larova Biochemie GmbH, Teltow
Dextransulfat Sigma, Deisenhofen
Dichlorethan Fluka, Neu-Ulm
DIG-11-dUTP Roche Diagnostics, Mannheim
Dimethylsulfoxid Fluka, Neu-Ulm
Dithiothreitol Life Technologies, Karlsruhe
Heringsperma-DNA Roche Diagnostics, Mannheim
Hexamer-Nukleotid-Gemisch Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg
Kanamycin Serva, Heidelberg
Kresolrot Sigma, Deisenhofen
Natriumdodecylsulfat Merck, Darmstadt
N-Methylimidazol Fluka, Neu-Ulm
Oligo(dT)12-18 Life Technologies, Karlsruhe
Poly-L-Lysin Sigma, Deisenhofen
Rinderserumalbumin Serva, Heidelberg
RotiPhenol, pH 8.0 Roth, Karlsruhe
tRNA Roche Diagnostics, Mannheim
2.1.2. Enzyme
Taq Polymerase wurde aus dem überproduzierenden Stamm DH5α/pTP4 (L. Schalk- wyk, ICRF, London, UK) isoliert (Pluthero, 1993).
DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment MBI Fermentas, St. Leon-Roth
EcoRI MBI Fermentas, St. Leon-Roth
MboI New England Biolabs, Schwalbach
Proteinase K Roche Diagnostics, Mannheim
Pronase E Serva, Heidelberg
Ribonuklease A Sigma, Deisenhofen
SuperScriptII Life Technologies, Karlsruhe
T4-DNA-Ligase Life Technologies, Karlsruhe
Taq DNA-Polymerase Qiagen, Hilden
2.1.3. DNA-Längenstandards
Für die Gelelektrophorese wurden folgende Längenstandards verwendet:
SmartLadder (Eurogentec, Brüssel), Banden bei:
200 bp; 400 bp; 600 bp; 800 bp; 1000 bp; 1500 bp; 2000 bp; 2500 bp; 3000 bp;
4000 bp; 5000 bp; 6000 bp; 8000 bp; 10.000 bp.
GeneRuler™ (MBI Fermentas, St. Leon-Roth), Banden bei:
100 bp; 200 bp; 300 bp; 400 bp; 500 bp; 600 bp; 700 bp; 800 bp; 900 bp; 1031 bp;
1200 bp; 1500 bp; 2000 bp; 3000 bp.
2.1.4. Primer für PCR
Alle PCR-Primer wurden von ThermoHybaid, Ulm bezogen. Sie hatten alle die Quali- tätsstufe "gereinigt durch RP-HPLC".
Die Primer-Sequenzen wurden mit dem Programm "primer3" (http://www- genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi, Whitehead Institute, USA) ermittelt.
PCR-Primerpaare DNA-Sequenz
T7 5`- TAATACGACTCACTATAGGG –3`
T3 5`- AATTAACCCTCACTAAAGGG –3`
rabbit-α-globin-forward 5`- CTCTGAGCAGATCAAAGCCC –3`
rabbit-α-globin-reverse 5`- ATATTTGGAGGTCAGCACGG –3`
rabbit-β-globin-forward 5`- GTGAGGAGAAGTCTGCGGTC –3`
rabbit-b-globin-reverse 5`- GAAGTCAGATGCTCAAGGGG – 3`
2.1.5. Häufig verwendete Puffer, Medien und Lösungen
DEPC-H2O 1 ml DEPC
ad 1 l H2O,
ÜN bei 37°C inkubieren, autoklavieren DNA-Auftragspuffer 0,25 % Bromphenolblau
0,25 % Xylencyanol 30 % Glycerin
in H2O
Medien
2YT-Medium 1,6 % (w/w) Bacto Tryptone 1 % (w/w) Bacto Yeast Extract 0.5 % (w/w) NaCl
96.9 % (w/w) H2O
autoklavieren
2YT-Agar 1.5 % (w/w) Bacto Agar
1,6 % (w/w) Bacto Tryptone 1 % (w/w) Bacto Yeast Extract 0.5 % (w/w) NaCl
96.9 % (w/w) H2O
autoklavieren 10x H.M.F.M.: 3 mM MgSO4 x 7 H2O
15 mM Tri-Natriumcitrat x 2 H2O 70 mM (NH4)2SO4
55 % (w/v) Glyzerin
ad 800 ml H2O, autoklavieren 270 mM KH2PO4
130 mM K2HPO4
ad 200 ml H2O, autoklavieren, nach getrenntem Autoklavieren beide Lösungen vereinigen
2YT-F: 2YT
10 % 10x H.M.F.M 50x Vogels Medium 150 g Na3-citrat x 5 H2O
250 g KH2PO4
100 g NH4NO3
10 g MgSO4 x 7 H2O 5 g CaCl2 x 2 H2O
ad 1 l H2O
+ 2-3 ml Chloroform 1x Vogels Medium 20 ml 50x Vogels Medium
1 ml 10 mg/ml Biotin (in 50% EtOH) 1 ml Spurenelemente-Lsg.
autoklavieren
Spurenelemente-Lsg. 5g Citronensäure x 1 H2O 5g ZnSO4
1g Fe(NH4)2(SO4)2 x 6 H2O 0,25 g CuSO4 x 5 H2O
0,05 g MnSo4 x 1 H2O 0,05 g H3BO3
0,05 g Na2MoO4 x 4 H2O ad 100 ml H2O
Lösung I: 50 mM Glucose
25 mM Tris-HCl, pH 8.0 10 mM EDTA
Lösung II: 0.2 M NaOH
1 % SDS
Lösung III: 5 M KOAc
2 M HOAc Hybridisierung auf Klonfilter
Church-Puffer: 0.5 M Na-phosphat, pH 7.2 7 % (w/w) SDS
1 mM EDTA
Waschpuffer: 40 mM Na2HPO4, pH 7.2 0.1 % (w/w) SDS
Hybridisierungspuffer: Church-Puffer 0.1 mg/ml Fischsperma-DNA Regenerations-Puffer: 5 mM Na-phosphat
0.1 % (w/w) SDS
Radioaktive Markierung von DNA
LS-Mix: 5 l Oligo-Puffer OL
175 l TM-Puffer 175 l Hepes, pH 6.6 Oligo-Puffer OL: 45 U/ml Primer dN6
1 mM Tris-HCl, pH 8.0 1 mM EDTA, pH 8.0
TM-Puffer: 250 mM Tris-HCl, pH 8.0
25 mM MgCl2
50 mM β-Mercaptoethanol Prozessieren von Nylon-Filtern
Denaturierungspuffer: 0.5 M NaOH 1.5 M NaCl
Neutralisierungspuffer: 1 M Tris-HCl, pH 7.6 1.5 M NaCl
Pronase-Puffer: 50 mM EDTA
100 mM NaCl
1% (v/v) Sarcosyl NL-30 50 mM Tris-HCl, pH 8.5
0.25 mg/ml Pronase (frisch einwiegen!) Digoxigenin-Detektion mit CSPD®
Maleinsäure-Puffer: 0.1 M Maleinsäure 1.15 M NaCl
mit NaOH auf pH 7.5 einstellen, autoklavieren
CSPD®-Waschpuffer : Maleinsäurepuffer 0.3% (v/v) Tween 20
10x Blocking: 10% (w/v) Blockierungsreagenz
in Maleinsäurepuffer, autoklavieren Detektionspuffer: 0.1 M Tris-HCl, pH 9.5
0.1 M NaCl
Antikörper-Verdünnung: Anti-DIG-AP-Konjugate 1:10000 in Maleinsäurepuffer
CSPD®-Lösung: CSPD® 1:100
in Detektionspuffer
PCR
10x PCR-Puffer 500 mM KCl
100 mM Tris-HCl, pH 8,3
2.1.6. Verwendete Chemikaliensätze
Gigapack® III XL Packaging Extract Stratagene, La Jolla, CA, USA QIAprep® Spin Miniprep Kit Qiagen, Hilden
QIAGEN® Plasmid Mini Kit Qiagen, Hilden
2.1.7. Materialien
Agarplatten, 12x8 cm Nunc, Wiesbaden
Agarplatten, 22x22cm Nunc, Wiesbaden
Autoradiographie-Film Hyperfilm™-MPAmersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg
Eppendorfgefäße, 1.5 ml und 2.0 ml Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg Falcon, 50 ml und 15 ml Becton Dickinson, Heidelberg
Glas-Chips Menzel, Braunschweig
Hybond™-N+-membranen, 22x22 cm Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg Hybridisierungsflaschen Glasbläser, DKFZ Heidelberg
Hybridisierungskammern Telechem, Sunnyvale, USA Kimwipes lite Präzisionstücher Roth, Karlsruhe
Lumi-Film Roche Diagnostics, Mannheim
Mikrotiterplatten, 384er Nunc, Wiesbaden Mikrotiterplatten, 384er Nunc, Wiesbaden MultiScreen-PCR Platten Millipore, Eschborn
PCR-Mikrotiterplatten, 384er MJ Research, Waltham MA, USA
Pizza-Boxen Genetix, Christchurch, UK
Plastikreplikatoren, 384er, NrX5050 Genetix, Christchurch, UK Polyfiltronics, 384er Whatman Inc., Clifton, USA
Spotting-Pins SMP3 Telechem, Sunnyvale, USA
UV-Küvette (Uvette) Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburg Whatman 3MM-Papier Bender und Hobein, Bruchsal
2.1.8. Geräte
Heizblock Grant Instruments, Cambridge, UK
Photometer Ultrospec 2000 Amersham-Pharmacia-Biotech, Freiburg Roboter "BioGrid" BioRobotics, Cambridge, UK
Rotationsofen H. Saur Laborbedarf, Reutlingen
ScanArray 5000 GSI Lumonics, Unterschleissheim
Schüttler mit Wasserbad "Belly Dancer" CLF Laborgeräte, Emersacker SDDC-2 MicroArrayer Eurogentec, Darmstadt
Sparc-V-Computer Sun Microsystems, Langen
Thermocycler PTC-200 MJ Research, Waltham MA, USA UV-Crosslinker UVC 500 Hoefer, San Francisco, USA Vakuum-Konzentrator H. Saur Laborbedarf, Reutlingen Videosystem Geldoc 1000 Biorad, München
Zentrifuge "Biofuge pico" Heraeus Instruments, Hanau
Zentrifuge "Megafuge 1.0R" Heraeus Instruments, Hanau
Zentrifuge, Sorval RC 2-B Dupont Instruments, Bad Homburg
2.1.9. Bibliotheken
2.1.9.1. Genomische Cosmid-Bibliothek
Für die physikalische Kartierung wurde von Dr. J. Arnold (University of Georgia, Athens, USA) und dem Fungal Genetics Stock Center (FGSC, Kansas, USA) eine ge- nomische Cosmid-Bibliothek zur Verfügung gestellt, die sich aus zwei Sub- Bibliotheken zusammensetzt. Die Sub-Bibliotheken unterschieden sich in ihrer Größe und in den ihnen zugrunde liegenden Klonierungsvektoren.
Tabelle 2.1: Genomische Cosmid-Bibliotheken vom FGSC Vektor Antibiotika-
Resistenz
Anzahl Klone
Anzahl
96er Platten Hersteller
pLORIST6Xh Kanamycin 12000 125 H. Kelkar, 2001
pMOcosX Ampicillin 4800 50 M. Orbach, 1994
Die durchschnittliche Insertgrösse beträgt 34 kb (Kelkar et al., 2001), beide Bibliothe- ken zusammen haben damit eine 13-fache Abdeckung des Genoms von N. crassa.
2.1.9.2. Genomische BAC-Bibliothek
Die genomische BAC-Bibliothek wurde von LION Bioscience (Heidelberg) zur Verfü- gung gestellt.
Tabelle 2.2: Genomische BAC-Bibliothek Vektor Antibiotika-
Resistenz
Anzahl Klone
Anzahl
96er Platten Hersteller
pBeloBACKan Kanamycin 9216 24 LION Bioscience
Die durchschnittliche Insertgrösse, ermittelt aus 20 zufällig ausgewählten Klonen, be- trägt 69 kb (persönl. Mitteilung, T. Schlüter). Damit ergibt sich für die Bibliothek eine
2.1.9.3. cDNA-Bibliothek
Vom "Neurospora Genome Project" (University of New Mexico, USA) wurde eine uni- direktionale cDNA-Bibliothek zur Verfügung gestellt. Sie beinhaltet 4700 Klone und wurde mit dem Uni-ZAP XR Vektorsystem (Stratagene, La Jolla, USA) hergestellt (Nelson et al., 1997). Dabei wurde mRNA aus drei verschiedenen Entwicklungsstadien verwendet, Conidien, Mycel und Perithecium. Für diese drei Sub-Bibliotheken ergaben sich folgende durchschnittliche Insertgrössen (Nelson et al., 1997):
Tabelle 2.3: Insertgrössen cDNA-Bibliothek
Gewebe Insertgrö- sse
Conidien 1,3 kb
Mycel 1,5 kb
Perithecium 1,7 kb
Die bisher ermittelten cDNA-Sequenzen wurden in der Genome Sequence DataBase (GSDB) des National Center for Genome Resources (NCGR) und unter http://biology.unm.edu/~ngp/home.html veröffentlicht.
2.2. Methoden Physikalische Kartierung
2.2.1. Anzucht und Replikation von genomischen Bibliotheken
Die genomische Cosmid-Bibliothek, die freundlicherweise von Dr. J. Arnold (Univer- sity of Georgia, Athens, USA) und dem FGSC (Kansas, USA) zur Verfügung gestellt wurde, lag zunächst in insgesamt 175 Mikrotiterplatten im 96er Format vor. Für eine einfachere Handhabung wurde die Bibliothek mit Hilfe des Roboters "BioGrid" in 384er Platten repliziert, so dass sich der Umfang der Bibliothek auf 44 Platten reduzierte. Die Platten waren mit 2YT-F-Medium gefüllt, dem je nach Vektor (siehe 2.1.9.1.) 50 µg/ml Ampicillin oder 50 µg/ml Kanamycin zugesetzt war. Nach Inkubation bei 37°C für 16 h wurden durch Animpfen frischer Mikrotiterplatten mit 384er Plastikreplikatoren zwei Kopien der Bibliothek erstellt, die ebenfalls über Nacht bei 37°C inkubiert wurden. Die Bibliotheken wurden bei -80°C gelagert. Die Benennung der Klone erfolgte entspre- chend ihrer Positionierung in den Koordinaten der 384er Mikrotiterplatten.
Die genomische BAC-Bibliothek, die von der Firma LION Bioscience (Heidelberg) zur Verfügung gestellt wurde, lag in 24 Mikrotiterplatten im 384er Format vor. Mit Hilfe des Roboters "BioGrid" wurde die Bibliothek sechsmal in mit 2YT-F-Medium und 30 µg/ml Kanamycin gefüllte 384er Mikrotiterplatten kopiert. Nach Inkubation für 16 h bei 37°C wurden die Platten bei -80°C gelagert.
2.2.2. Herstellung genomische Cosmid-Bibliothek
Zusätzlich zu der Cosmid-Bibliothek vom FGSC (Kansas, USA) wurde eine weitere Cosmid-Bibliothek hergestellt. Als Klonierungsvektor diente hierbei pLawrist4.
2.2.2.1. Präparation genomischer DNA aus Neurospora crassa
Als Material für die Präparation hoch-molekularer genomischer DNA aus Neurospora crassa diente bei -80°C gefrorenes Mycel vom Wildtypstamm 74-OR23-1A, das freundlicherweise von Dr. U. Schulte (Uni Düsseldorf) zur Verfügung gestellt wurde.
Zunächst wurde ein 500 ml Erlenmeyerkolben mit 20 ml TEN9 (100 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 9.0, 200 mM NaCl) und 100 µg/ml RNase A bereit gestellt.
war, unter Zugabe von flüssigem Stickstoff pulverisiert und sofort unter vorsichtigem Schwenken portionsweise mit einem vorgekühlten Löffel in den Erlenmeyerkolben überführt. Die Lösung wurde in ein 50 ml Falcon-Reaktionsgefäß gefüllt, mehrmals vorsichtig invertiert und 10 min bei 30 rpm auf dem Rollschüttler bewegt. Nach Zugabe von 1 ml 20 %igem SDS folgten nach mehrmaligem Invertieren weitere 10 min auf dem Rollschüttler bei 30 rpm. Anschließend wurde 1 ml 10 mg/ml Proteinase K zugegeben und die Lösung über Nacht bei 37°C auf dem Rollschüttler bei 30 rpm inkubiert. Die Lösung wurde 10 min bei 3000 rpm und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 20 ml Phenol, pH 8.0, versetzt, zwei Stunden bei 30 rpm geschüttelt und anschliessend 10 min bei 3000 rpm zentrifugiert. Mit der wässrigen Phase wurde die Phenol- Extraktion wiederholt und anschliessend 20 min bei 9000 rpm und 25°C zentrifugiert.
Der Überstand wurde zur Fällung mit dem 0.8-fachen Volumen Isopropanol und dem 0.1-fachen Volumen 3 M NaOAc versetzt. Nach 20 min Zentrifugation bei 9000 rpm und 4°C wurde das DNA-Sediment in 400 µl H2O gelöst. Zur Kontrolle wurde ein Ali- quot der DNA auf einem Agarosegel überprüft, die Bestimmung der Konzentration er- folgte photometrisch oder fluorimetrisch.
2.2.2.2. Partialrestriktion genomischer DNA und Dephosphorylierung
35 µg genomische DNA von N. crassa wurden in einem Endvolumen von 200 µl 1x NEB-4-Puffer mit 5 U MboI bei 37°C hydrolysiert. Nach 1 min, 2 min, 3 min, 4 min, 5 min, 8 min, 30 min und 60 min wurden Aliquots von je 25 µl entnommen; die Re- striktionshydrolyse wurde in den Aliquots durch Zugabe von je 25 µl 0.5 M EDTA und anschliessender Inkubation bei 68°C für 10 min gestoppt.
Nach einer Phenol- und einer Chloroform/Isoamylalkohol (24:1)-Extraktion mit jeweils gleichen Volumina wurde die DNA durch Zugabe vom 0.1-fachen Volumen 5 M NaCl und dem 2.5-fachen Volumen Ethanol gefällt. Nach einer Zentrifugation bei 15000 rpm und 4°C für 20 min wurde das DNA-Sediment in 44 µl H2O gelöst.
Die DNA-Lösung wurde mit 5 µl 10x NEB-4-Puffer und 1 µl alkalischer Phosphatase versetzt und 1 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch 10 minütiges Inkubieren bei 70°C gestoppt. Zur vollständigen Inaktivierung der alkalischen Phosphatase wurden zum Reaktionsansatz 2 µl 0.5 M EDTA, 2 µl 20% SDS und 2 µl 10 mg/ml Proteinase K gegeben und 30 min bei 56°C inkubiert. Nach Phenol- und Chloroform/Isoamylalkohol (24:1)-Extraktion mit anschliessender Ethanol-Fällung und Zentrifugation (siehe oben)
wurde die DNA in 16 µl H2O aufgenommen. Ein Aliquot der Partialrestriktionsansätze wurde auf einem Agarosegel überprüft.
2.2.2.3. Ligation der N. crassa-DNA in den Vektor pLawrist-4
5 µl aus den Partialrestriktionsansätzen wurden in einem Endvolumen von 15 µl 1x T4- DNA-Ligasepuffer mit 2 µg pLawrist-4 Vektorarmen, 4 mM ATP und 1 µl T4-DNA- Ligase (1U/µl ) über Nacht bei 16°C ligiert. Die Lagerung der Ligationsprodukte er- folgte bei 4°C für maximal 4 Wochen.
2.2.2.4. Transfektion
Die Transfektion der Ligationsprodukte in E. coli DH5α erfolgte mit dem Gigapack® III XL Packaging Extract nach Anweisungen des Herstellers. Je 600 µl des Transfekti- onsansatzes wurden auf 2YT/Kanamycin (30 µg/ml)- Agarplatten (22x22 cm) ausge- strichen und für 12-16 h bei 37 °C inkubiert.
2.2.2.5. Überführung von Klonen in Mikrotiterplatten
Mit Hilfe von sterilen Zahnstochern wurden einzelne Kolonien in 384er Mikrotiterplat- ten überführt, die zuvor mit 2YT-F-Medium und 30 µg/ml Kanamycin befüllt worden waren. Die Platten wurden bis zu 24 h bei 37°C inkubiert. Durch Animpfen frischer Mikrotiterplatten mit 384er Plastikreplikatoren wurden zwei Kopien der Bibliothek er- stellt. Die Lagerung der Bibliothek erfolgte bei -80°C.
2.2.3. Herstellung von DNA-Filtern
Zunächst wurden Hybond N+-Membranen luftblasenfrei auf mit 300 ml 2YT/Antibiotikum-Agar gefüllte Nunc-Schalen (22x22 cm) gelegt. Der Transfer der Klone auf die Filter erfolgte mit Hilfe des Roboters "BioGrid", der das Erstellen eines hochdichten Rasters mit bis zu 70 Klonen pro cm2 ermöglichte. Ein 384er Metallnadel- replikator brachte jeden Klon doppelt in einer definierten Anordnung auf die Filter auf.
Je nach Anzahl der Klone können verschiedene Raster gewählt werden, in der vorlie- genden Arbeit wurde meist das 4x4-Raster, aber auch das 2x2-Raster verwendet. Dabei wird der Filter in 6 Felder unterteilt, jedes 7x11 cm gross, entsprechend der Grösse ei- ner Mikrotiterplatte und somit des Metallnadelreplikators.
Abb. 2.1: Raster, in dem die Klone auf die Filter aufgebracht werden. A): Einteilung des Filters in 6 Felder, B) Ansicht eines Feldes mit der Koordinatenbenennung mit Anordnung der doppelt aufgebrachten Klone im C) 4x4-Raster oder D) 2x2-Raster
1 2
Feld 1
Feld 3
Feld 2
Feld 4
Feld 5 Feld 6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1617 18 19 20 21 22 23 24 A
B C D E F G H I J K L M N O P
1 2 3 4
5 6 7 8
A)
C) D)
B)
Wird in Abhängigkeit der zu transferierenden Klon-Bibliothek nicht die gesamte Filter- grösse beansprucht, können bis zu sechs Kopien einer Bibliothek auf die sechs Felder eines Filters transferiert werden, die nach der anschliessenden Prozessierung mit einem Skalpell in einzelne Filter zerschnitten werden.
Anschliessend wurden die Agar-Platten mit den Membranen über Nacht bei 37°C inku- biert. Die Inkubationszeit wurde dabei so gewählt, dass die Kolonien zwar möglichst gross wurden, benachbarte Kolonien aber noch deutlich voneinander getrennt waren.
Die DNA wurde in situ auf dem Filter gebunden (Hoheisel et al., 1991). Dazu wurden die Filter zunächst zweimal für je 4 min auf mit Denaturierungspuffer getränktem Whatman 3MM-Papier bei Raumtemperatur inkubiert, anschliessend wurden die Filter für mindestens 5 min auf ein mit Neutralisierungspuffer getränktes Whatman 3MM- Papier gelegt. Die neutralisierten Filter wurden in 400 ml Pronase-Puffer 1 h bei 37°C inkubiert, das Einbringen der Filter in den Puffer erfolgte so vorsichtig und langsam, dass die Filter zwar vollständig von Puffer bedeckt waren, die Kolonien jedoch nicht abgespült wurden. Anschliessend wurden die Filter auf Whatman 3MM-Papier bei Raumtemperatur vollständig getrocknet. Die trockenen Filter wurden im Crosslinker mit UV-Licht mit einer Energie von 1200 x 100 µJ/cm2 bestrahlt, wodurch die DNA auf den Filtern fixiert wurde. Zwischen den Hybridisierungen wurden die Filter in Church-Puffer gelagert, zur längerfristigen Lagerung wurden sie getrocknet.
2.2.4.Selektion Chromosom II- bzw. V spezifischer Cosmid-Bibliotheken Zunächst wurden DNA-Filter hergestellt (siehe 2.2.3.), die sowohl die Cosmid- Bibliothek vom FGSC in den Vektoren pLORIST6Xh und pMOcosX als auch die Cos- mid-Bibliothek im Vektor pLawrist-4, die im Rahmen dieser Arbeit angefertigt wurde (siehe 2.2.2.), enthielten. Jeweils 70 ng chromosomale DNA der Chromosomen II und V, die freundlicherweise von Dr. U. Schulte zur Verfügung gestellt wurde, wurde wie in 2.2.8. beschrieben radioaktiv markiert und auf die Cosmid-Filter hybridisert. Die Aus- wertung der Autoradiographien erfolgte manuell. Frische Mikrotiterplatten wurden mit Hilfe von sterilen Zahnstochern mit den Cosmid-Klonen, die positive Signale zeigten, angeimpft, von den chromosomenspezifischen Bibliotheken wurden je 3 Kopien ange- legt (2.2.1.).
2.2.5.Selektion einer Chromosom II-spezifischen BAC-Bibliothek
Zur Selektion einer Chromosom II-spezifischen BAC-Bibliothek wurden zunächst DNA-Filter mit der gesamten BAC-Bibliothek hergestellt (2.2.3.). Auf diese wurde DNA von Cosmid-Klonen, die schon, wie in 2.2.4. beschrieben, als Chromosom-II- spezifisch identifiziert worden waren, hybridisiert. Die Markierung der DNA erfolgte unter Verwendung von Digoxigenin (2.2.9.). Die Klone wurden entweder einzeln oder in Gruppen von zwei oder drei Klonen hybridisiert. Die BAC-Klone mit positivem Hy- bridisierungssignal wurden in frische Mikrotiterplatten transferiert, die Platten wurden anschliessend mehrfach kopiert (2.2.1).
2.2.6.Präparation von Cosmid-DNA
Die Präparation von Cosmid-DNA erfolgte durch alkalische Lyse (Birnboim & Doly, 1979). Flüssigkulturen wurden durch Animpfen von je 5 ml 2YT-Medium und 30 µg/ml Kanamycin bzw. 50 µg/ml Ampicillin mit Bakterienklonen angelegt und 16 h bei 37 °C unter Schütteln bei 220 rpm inkubiert. Die Kulturen wurden 10 min bei 4000 rpm zen- trifugiert, die sedimentierten Zellen wurden in 100 µl Lösung I resuspendiert, in ein 1.5 ml Eppendorfgefäss überführt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschlie- ssend wurden zur alkalischen Lyse 200 µl Lösung II zugegeben, vorsichtig gemischt und 5 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 150 µl Lösung III wurde 15 min auf Eis inkubiert, anschliessend wurden die festen Zellbestandteile 10 min bei 13000 rpm ab- zentrifugiert. Zur Entfernung von RNA wurde der Überstand mit 10 µl 10 mg/ml RNase A versetzt und mindestens 1 h bei 37°C inkubiert. Die Lösung wurde zunächst mit dem gleichen Volumen Phenol, pH 8.0, anschliessend mit dem gleichen Volumen Chloro- form/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Durch Zugabe vom 2.5-fachen Volumen Ethanol und dem 0.1-fachen Volumen 3 M NaOAc, pH 5.2 wurde die DNA bei -70°C für min- destens 30 min gefällt. Nach Abzentrifugation für 30 min bei 13000 rpm, Waschen mit 70 %igem Ethanol und Trocknen wurde die DNA in 50 µl H2O gelöst. Zur Überprüfung der DNA-Qualität durch Restriktionsanalyse wurden 3 µl der DNA-Lösung mit 0.5 µl EcoRI, 1 µl 10x EcoRI-Puffer und 5.5 µl H2O versetzt, 1 h bei 37°C inkubiert und auf einem 1 %igem Agarosegel überprüft.
2.2.7.Präparation von BAC-DNA
Die Präparation von BAC-DNA erfolgte nach einem modifiziertem Protokoll des QIA- prep® Spin Miniprep Kits. Verwendet wurden die vom Hersteller gelieferten Säulen und Puffer, lediglich Puffer N3 wurde durch den Puffer P3 aus dem QIAGEN® Plasmid Mini Kit ersetzt. Zunächst wurden Flüssigkulturen angelegt, indem 7 ml 2YT-Medium und 30 µg/ml Kanamycin mit Hilfe eines Zahnstochers mit Bakterienklonen aus der gefro- renen Bibliothek angeimpft wurden und ca. 16 h bei 37°C unter Schütteln bei 220 rpm inkubiert wurden. Die Bakterienzellen wurden durch 20 minütige Zentrifugation bei 4000 rpm sedimentiert. Um die Ausbeute an BAC-DNA zu maximieren, erwies es sich als unerlässlich, die Resuspension der Zellen in Puffer P1, die Lyse der Zellen in Puffer P2 und die Neutralisation des Lysats mit Puffer P3 für jeden Klon direkt nacheinander und ohne Verzögerung durchzuführen und nicht etwa bei der parallelen Präparation vieler Klone zunächst alle mit Puffer P1, dann alle mit Puffer P2 und anschliessend alle mit Puffer P3 zu behandeln, wie dies z.B. bei Plasmid- oder auch Cosmid-Präparationen möglich ist.
Das Zellsediment wurde in 250 µl Puffer P1 und 200 µg/ml RNase A resupendiert und in ein 2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäss überführt. Nach sofortiger Zugabe von 250 µl Puffer P2 und Mischen durch mehrmaliges Invertieren wurden 350 µl Puffer P3 zuge- geben und vorsichtig gemischt. Nach Zentrifugation für 10 min bei 13000 rpm wurde der Überstand durch Zugabe von 590 µl Isopropanol 30 min bei -20°C gefällt. Die DNA wurde 30 min bei 13000 rpm zentrifugiert, mit 500 µl 70 %igem Ethanol gewaschen und nach Trocknen bei Raumtemperatur in 26 µl H2O aufgenommen. Nach der Zugabe von 3 µl 10x EcoRI-Puffer und 0.5 µl EcoRI wurde 1 h bei 37°C inkubiert. Der Re- striktionsansatz wurde mit 150 µl Puffer PB versetzt und auf die QIAprep®-Säule auf- getragen. Die Säule wurde 1 min bei 13000 rpm zentrifugiert und der Durchfluss ver- worfen. Anschliessend wurde die Säule mit 750 µl Puffer PE gewaschen, 1 min zentri- fugiert, und nach Verwerfen des Durchflusses erneut 1 min zentrifugiert. Die Elution erfolgte mit 30 µl 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, das auf 65°C temperiert worden war. Auf einem 1 %igem Agarosegel wurden 8 µl des Eluats überprüft.
2.2.8.Hybridisierung mit radioaktiv markierter DNA
2.2.8.1. Radioaktive Markierung der DNA
Die radioaktive Markierung der Sonden erfolgte nach der Methode des "Random Hexa- mer Priming" von Feinberg und Vogelstein (1983). Bei dieser Methode wird die DNA ausgehend von zufälligen Hexamer-Primern mit dem Klenow-Fragment repliziert, wo- bei durch den Einbau von [α-32P]-dCTP eine radioaktive Markierung erfolgt.
Für die Herstellung von radioaktiv markierten Sonden wurden 20-500 ng Cosmid-DNA (2.2.6.) in 15 µl H2O 5 min bei 95°C denaturiert, anschliessend sofort auf Eis gekühlt und mit 18 µl LS-Mix, 0.75 µl 20 mg/ml BSA, 1 µl AGT-dNTP-Mix (je 0.5 M dATP, dGTP und dTTP), 10 µCi [α-32P]-dCTP und 6 U Klenow-Fragment für mindestens 3 h bei 37°C inkubiert.
Zur Entfernung nicht eingebauter Nukleotide wurde die DNA durch Zugabe von 2 µl 10 mg/ml tRNA oder Heringsperma-DNA, 2 µl 0.5 M EDTA, 2 µl H2O, 10 µl 3 M NaOAc und 40 µl Isopropanol 30 min bei -80°C gefällt. Nach Zentrifugation für 30 min bei 13000 rpm wurde das Sediment in 100 µl H2O aufgenommen und direkt in die Hybridisierung eingesetzt.
2.2.8.2. Hybridisierung der radioaktiv markierten Sonden
Die Hybridisierungen wurden in Glasflaschen (Durchmesser 3.5 cm, Länge 16 cm für 13x8 cm große Filter, Länge 30 cm für 22x22 cm große Filter) in einem beheizbaren Hybridisierschrank unter ständiger Rotation durchgeführt. Um einen Druckausgleich zu gewährleisten, waren die Schraubverschlüsse der Glasflaschen in der Mitte durchbohrt.
Die Filter wurden mit der DNA-Seite nach innen luftblasenfrei an die Innenwand der Flaschen gelegt, je nach Filterzahl und Größe auch überlappend. Zunächst wurde eine Vorhybridisierung mit 10 ml (kleine Flaschen) bzw. 15 ml (große Flaschen) Hybridisie- rungspuffer für 2 h bei 65°C durchgeführt. Anschliessend wurde die markierte Sonde (2.2.8.1.) 5 min bei 95 °C denaturiert, auf Eis gekühlt und direkt in den Hybridisie- rungspuffer der Vorhybridisierung gegeben. Die Hybridisierung erfolgte bei 65°C für 12-16 h. Zum Waschen wurden die Filter zunächst einzeln bei Raumtemperatur kurz mit Waschpuffer gespült. Anschliessend wurden bis zu 20 kleine Filter oder bis zu 5 große Filter gemeinsam in einer Plastikbox in 500 ml Waschpuffer bei 65°C unter leichtem Schwenken 10-30 min gewaschen.
