Die (βα)8-Barrel Enzyme HisA und HisF lieferten nicht nur wichtige Hinweise auf die Evolution der Faltung aus (βα)4-Halbbarreln (siehe Kapitel 1.4), sondern trugen auch zum Verständnis der Entstehung unterschiedlicher katalytischer Aktivitäten bei. HisA und HisF sowie PRA-Isomerase (TrpF) und IGP-Synthase (TrpC) katalysieren jeweils zwei analoge aufeinanderfolgende Reaktionen in der Biosynthese von Histidin bzw.
Tryptophan (Abbildung 2).
Abbildung 2: (βα)8-Barrel Enzyme katalysieren analoge Reaktionen in der Histidin- und Tryptophanbiosynthese.
HisA und TrpF katalysieren Amadori-Umlagerungen von einer Aminoaldose in eine Aminoketose. HisF und TrpC katalysieren die Ringschlussreaktionen, die zu ImGP bzw. IGP führen. Das zweite Produkt der HisF-Reaktion, AICAR, wird in der de novo Purin-Biosynthese verwendet. Um ImGP und AICAR
zu bilden, verwendet HisF Ammoniak, das an der Glutaminase HisH durch Desaminierung von Glutamin zu Glutamat gebildet wird (Beismann-Driemeyer & Sterner, 2001).
Abkürzungen: AICAR: 5-Aminoimidazol-4-carboxamid-ribotid; CdRP: 1-(o-Carboxyphenylamino)-1-deoxyribulose-5-phosphat; Gln: Glutamin; Glu: Glutamat; HisA: ProFAR-Isomerase; HisF: Synthase Untereinheit der ImGP-Synthase; HisH: Glutaminase Untereinheit der ImGP-Synthase; IGP:
Indolglycerinphosphat; ImGP: Imidazolglycerinphosphat; PRA: Phosphoribosylanthranilat; PRFAR:
N’-[(5’-phosphoribulosyl)-formimino]-5-aminoimidazol-4-carboxamid-ribonukleotid; ProFAR: N’-[(5’-phosphoribosyl)-formimino]-5-aminoimidazol-4-carboxamid-ribonukleotid; TrpC: IGP-Synthase; TrpF:
PRA-Isomerase
HisA katalysiert den vierten Schritt in der Histidinbiosynthese, die Amadori-Umlagerung der Aminoaldose ProFAR zur Aminoketose PRFAR (Margolies &
Goldberger, 1966). Die anschließende Umwandlung von PRFAR in ImGP und AICAR wird von der ImGP-Synthase katalysiert, welche sich aus einem 1:1 Komplex aus HisF und HisH zusammensetzt (Klem & Davisson, 1993). ImGP wird im Verlauf des Biosyntheseweges weiter zu Histidin umgewandelt, während AICAR in die Purinbiosynthese eingeht. Die zur Superfamilie der Ribulose-Phosphat-bindenden (βα)8-Barrel gehörenden Enzyme HisA und HisF besitzen ca. 25 % identische und ca. 40 % ähnliche Aminosäuren (Thoma et al., 1998). Der Vergleich der Kristallstrukturen der beiden Enzyme aus T. maritima liefert einem rmsd-Wert für die Cα-Atome von nur 1,79 Å (Lang et al., 2000). So findet man an äquivalenten Positionen in der N- und der C-terminalen Hälfte zwei Phosphatbindestellen, die für die Bindung der zweifach phosphorylierten Substrate ProFAR und PRFAR wichtig sind (Thoma et al., 1998). Zusätzlich wurden in beiden Enzymen die gleichen katalytisch essenziellen Reste an äquivalenten Positionen der Struktur identifiziert, jeweils ein Aspartat am C-Terminus von β-Strang 1 (Asp8 in HisA und Asp11 in HisF) und am C-Terminus von β-Strang 5 (Asp127 in HisA und Asp130 in HisF; Henn-Sax et al., 2002; Beismann-Driemeyer & Sterner, 2001). Der stärkste Hinweis auf einen gemeinsamen evolutionären Ursprung von HisA und HisF ist die Fähigkeit von HisF zur Katalyse der HisA-Reaktion, wenn auch mit einer etwa 10.000-fach geringeren katalytischen Effizienz als HisA selbst. Für diese HisA-Fremdaktivität von HisF sind die gleichen Aspartate 11 und 130 verantwortlich, die auch essenziell für die HisF-Aktivität sind (Lang et al., 2000).
Ein analoges Paar von (βα)8-Barrel Enzymen wie HisA und HisF findet sich in der Tryptophanbiosynthese mit TrpF und TrpC, die den dritten und vierten Schritt der Reaktionskaskade katalysieren. TrpF und TrpC zeigen keine signifikante Sequenzübereinstimmung, bilden jedoch (βα)8-Barrel Strukturen aus, die im Bereich
der Bindestelle für die Phosphatgruppe des jeweiligen Substrats große Ähnlichkeiten aufweisen (Wilmanns et al., 1991).
Vergleicht man HisF und TrpC, so katalysieren beide Enzyme Ringschlussreaktionen zum ImGP bzw. IGP. Die Reaktionsmechanismen sind jedoch verschieden (Darimont et al., 1998; Hennig et al., 2002; Beismann-Driemeyer & Sterner, 2001), insbesondere weil HisF mit Ammoniak ein zweites Substrat benötigt, welches durch die assoziierte Glutaminase-Untereinheit HisH bereitgestellt wird.
Bei der von TrpF katalysierten Reaktion handelt es sich wie bei der von HisA um eine Amadori-Umlagerung der Aminoaldose PRA zur Aminoketose CdRP. HisA und TrpF unterscheiden sich somit nur in ihrer Substratspezifität, nicht aber in ihrem Reaktionsmechanismus (Henn-Sax et al., 2002). Die für die Katalyse essenziellen Reste von HisA und TrpF aus T. maritima liegen an analoger Position: Asp8 aus HisA und Cys7 aus TrpF finden sich an den C-terminalen Enden von β-Strang 1. Der Rest Asp127 und das für die Katalyse wichtige Thr164 aus HisA finden sich an den C-terminalen Enden von β-Strang 5 bzw. 6 und kommen in der Superpositionierung der beiden Röntgenstrukturen in enger räumlicher Nähe zu Asp126 aus TrpF zu liegen, welches am C-terminalen Ende von β-Strang 6 liegt. Die Kristallstruktur von TrpF aus T. maritima mit gebundenem Produktanalogon rCdRP (pdb: 1lbm) legt nahe, dass Asp126 als allgemeine Säure die Öffnung des Riboseringes katalysiert und Cys7 als allgemeine Base für die Deprotonierung von C-2ʼ verantwortlich sein könnte (Henn-Sax et al., 2002). Die gleiche Funktionsaufteilung gilt für die katalytisch essenziellen Reste von HisA (Quevillon-Cheruel et al., 2006). Diese Beobachtungen legen nahe, dass HisA und TrpF, ebenso wie HisA und HisF, durch divergente Evolution aus einem gemeinsamen Vorläufer hervorgegangen sind.
Diese Hypothese wird durch eine Reihe weiterer experimenteller Befunde unterstützt.
So konnte gezeigt werden, dass der Austausch der katalytisch essenziellen Reste Asp127 in HisA und Asp130 in HisF gegen eine nicht-negativ-geladene Aminosäure zur Etablierung von TrpF-Aktivität auf dem jeweiligen Enzym ausreicht (Jürgens et al., 2000; Leopoldseder et al., 2004). Dagegen ist die zweite katalytisch essenzielle Aminosäure (Asp8 in HisA und Asp11 in HisF) auch notwendig für die TrpF-Aktivität von HisA-D127V und HisF-D130V. In weiteren Arbeiten konnte das zu HisA homologe bifunktionelle (βα)8-Barrel Enzym PriA in Streptomyces coelicolor und Mycobacterium tuberculosis identifiziert werden, welches sowohl die HisA- als auch
die TrpF-Reaktion im jeweiligen Organismus katalysiert (Barona-Gómez & Hodgson, 2003; Kuper et al., 2005; Wright et al., 2008).
1.4 Die Evolution der (βα)8-Barrel Struktur aus (βα)4-Halbbarreln