2.2.1 pET-Vektoren
Gene, die in die multiple Klonierungsstelle (MCS) von pET-Vektoren (NOVAGEN, plasmid for expression by T7 RNA Polymerase) eingefügt wurden, werden durch die RNA-Polymerase des Phagen T7 (Studier et al., 1990) transkribiert. Die Expression der Gene erfolgt in speziellen E. coli Stämmen, die eine chromosomale Kopie der T7 RNA-Polymerase besitzen. Die Expression des T7 RNA-Polymerasegens erfolgt unter der Kontrolle eines lacUV5-Promotor-Operators und wird durch die Zugabe von Isopropyl-β-D-Thiogalaktopyranosid (IPTG) induziert. Das zur Unterdrückung der Expression erforderliche Gen für den lac-Repressor (lacI) liegt auf dem Plasmid und wird konstitutiv exprimiert.
pET15b
Im Vektor pET15b befinden sich stromaufwärts von der multiplen Klonierungsstelle sechs Histidin-Codone, gefolgt von der kodierenden Sequenz für die Schnittstelle der Protease Thrombin. Das hergestellte Protein trägt somit N-terminal einen Hexahistidin-Tag ((His)6-Tag), welcher nach Aufreinigung des Proteins über Nickel-Chelat-Affinitätschromatografie proteolytisch abgespalten werden kann. Der Vektor pET15b enthält die kodierende Sequenz für die β-Lactamase (bla), wodurch auf Ampicillin-Resistenz selektiert werden kann.
pET21a(+) & pET24a(+)
Die pET21a(+)- und pET24a(+)-Vektoren sind so konstruiert, dass unmittelbar stromabwärts der multiplen Klonierungsstelle sechs Histidin-Codone liegen. Das
hergestellte Protein trägt dadurch C-terminal einen (His)6-Tag, der eine Aufreinigung durch Nickel-Chelat-Affinitätschromatografie ermöglicht.
Nach Transformationen mit dem pET21a(+)-Vektor kann mittels der enthaltenen Ampicillin-Resistenz (bla) auf plasmidenthaltende E. coli Zellen selektiert werden. Im Falle von pET24a(+)-Vektoren erfolgt die Selektion über eine Kanamycin-Resistenz (kan). Beide Vektoren sind mit Ausnahme der ausgebildeten Resistenz identisch.
pETDuet-1
Der pETDuet-1-Vektor wurde zur Koexpression von zwei Genen konstruiert. Dazu enthält der Vektor zwei multiple Klonierungsstellen (MCS). Durch entsprechende Wahl der Restriktionsenzyme kann das Protein, dessen Gen in der ersten MCS kloniert vorliegt, mit einem N-terminalen (His)6-Tag versehen werden. Die MCS 1 besteht aus den Erkennungssequenzen für folgende Restriktionsenzyme: NcoI, BamHI, SacI, AscI, PstI, SalI, HindIII, NotI und AflII. Die erfolgreiche Klonierung in die MCS 1 kann mittels PCR über die Primerkombination 5ʼpET Upstream und 3ʼDuet Down 1 überprüft werden. Die MCS 2 besteht aus den Erkennungssequenzen folgender Restriktionsenzyme: NdeI, BglII, EcoRV, SgfI, AatII, KpnI, XhoI, PacI und AvrII. Die erfolgreiche Klonierung in die MCS 2 kann mittels PCR über die Primerkombination 5ʼDuet Up 2 und 3ʼT7 Terminator überprüft werden. Auf plasmidenthaltende E. coli Zellen wird mittels der enthaltenen Ampicillin-Resistenz (bla) selektiert.
Der Vektor wurde freundlicherweise von Prof. Frank Raushel (Texas A&M University, College Station, USA) zur Verfügung gestellt.
2.2.2 pER-Vektoren
pER-Vektoren basieren auf dem pET24a(+)-Vektor, dessen multiple Klonierungsstelle auf zwei Schnittstellen für die Restriktionsenzyme NdeI und NotI reduziert wurde. Zwischen den beiden Schnittstellen wurden Stoppcodone eingebracht, die jedes der drei möglichen Leseraster abdecken. Zusätzlich kommt es aufgrund einer Deletion zwischen den beiden Restriktionsschnittstellen zu einer Leserasterverschiebung. Diese Deletion wird beim Einfügen des jeweiligen Zielgens durch eine zusätzliche Base zwischen dem Ende des Gens und der Restriktionsschnittstelle kompensiert (im Rahmen dieser Arbeit wurde am 3ʼEnde der verwendeten Gene ein Guanin eingefügt). Dadurch erfolgt eine Synchronisation des
Leserasters des Zielgens mit dem eGFP-Gen (enhanced Green Fluorescent Protein), das der hinteren Schnittstelle folgt. Durch die Stoppcodone und die eingefügte Deletion soll die Expression von eGFP ohne eingefügtes Gen verhindert werden.
Die pER-Vektoren wurden von Dr. Ralf Thoma (ROCHE, Basel) konstruiert und zur Verfügung gestellt.
pER13a & pER13b Vektor
Im pER13a-Vektor (6003 bp) folgt auf die NotI-Schnittstelle eine für zehn Aminosäuren kodierende Linkerregion (Waldo et al., 1999) und anschließend das Gen für eGFP (Abbildung 5). Die Fluoreszenz von eGFP wird nicht wie die von GFP bei 396 nm angeregt, sondern bei 488 nm, was der verwendeten Wellenlänge des emittierten Lichts des Argonlasers im FACS entspricht.
Abbildung 5: Multiple Klonierungsstelle und 3’-seitig angrenzender Bereich von pER13a.
Gezeigt ist der Abschnitt von der Schnittstelle für NdeI bis zum eGFP-Gen. Die Aminosäuresequenz jedes Leserasters beginnend beim ATG der NdeI-Schnittstelle ist bis zum jeweiligen Stoppcodon unterhalb der DNA-Sequenz gezeigt. Die Linkerregion und das nachfolgende eGFP-Gen sind schematisch dargestellt.
Der pER13b-Vektor (6062 bp) entspricht im Aufbau und in der Funktion dem pER13a-Vektor mit dem Unterschied, dass vor der NdeI-Schnittstelle eine NcoI-Schnittstelle und ein (His)6-Tag eingefügt wurde.
Im Falle von beiden Vektoren erfolgt die Selektion über eine Kanamycin-Resistenz (kan).
pER14a
Der pER14a-Vektor ist in gleicher Weise konstruiert wie der pER13a-Vektor. An die NotI-Schnittstelle schließt sich jedoch ohne Linkerregion ein (His)6-Tag an. Dieser Vektor dient dazu, Gene aus dem pER13a-Vektor über einen NdeI/NotI-Restriktionsverdau ohne das eGFP-Gen umzuklonieren. Anschließend kann die Reinigung des exprimierten Genprodukts über Nickel-Chelat-Affinitätschromatografie erfolgen. Die Selektion erfolgt bei diesem Vektor ebenfalls über eine Kanamycin-Resistenz (kan).
2.2.3 pMal-c2
Bei dem Vektor pMAL-c2 (NEW ENGLAND BIOLABS, di Guan et al., 1988) wird das klonierte Gen stromabwärts von malE in eine Polylinker-Region eingesetzt, was zur Expression eines Fusionsproteins mit dem Maltose-Binde-Protein (MBP) aus E. coli führt. Durch den starken IPTG-induzierbaren Promotor Ptac wird eine hohe Expressionsrate gewährleistet. Das lacI-Gen für den lac-Repressor liegt ebenfalls auf dem Vektor. Das Fusionsprotein kann durch die hohe Affinität von MBP für Maltose mit einer Amylose-Säule aufgereinigt werden. Unmittelbar stromaufwärts der Polylinkerregion von pMAL-c2 liegt die Erkennungssequenz für die spezifische Protease Faktor Xa, wodurch nach der Aufreinigung das MBP vom Zielprotein abgespalten werden kann. Ein erfolgreich kloniertes Gen unterbricht das stromabwärts von malE liegende lacZα, wodurch positiv transformierte Klone eines α-Komplementationsstammes (z. B. JM107) auf X-Gal-Platten weiß statt blau erscheinen. Als Selektionsmarker enthält pMAL-c2 die kodierende Sequenz für die β-Lactamase (bla), welche transformierten Zellen eine Ampicillin-Resistenz verleiht.
2.2.4 pQE-Vektoren
Die kommerziellen pQE-Expressionsplasmide (QIAGEN) gehören zur pDS-Plasmidfamilie (Bujard et al., 1987) und basieren im Gegensatz zu pET-Plasmiden auf einem T5-Promotor Transkriptions-Translationssystem. Das Promotor/Operator-Element besteht aus einem Phagen T5-Promotor und zwei lac-Operator-Sequenzen, welche die Wahrscheinlichkeit der lac-Repressor-Bindung erhöhen und so die Repression des leistungsstarken T5-Promotors garantieren. Dieser wird von der E.
coli-eigenen RNA-Polymerase erkannt, wodurch ein inseriertes Gen in allen E. coli Expressionsstämmen transkribiert werden kann. Als Terminatorsequenzen stehen t0
des Lambda Phagen und T1 aus dem E. coli rrnB Operon zur Verfügung. Eine synthetische Ribosomenbindestelle RBSII vor der MCS ermöglicht die effiziente Translation der transkribierten mRNA.
pQE-70
Der pQE-70 Vektor (QIAGEN) besitzt stromabwärts der multiplen Klonierungsstelle einen (His)6-Tag, wodurch das exprimierte Protein diesen C-terminal bei Klonierung über die Restriktionsschnittstellen SphI und BamHI trägt. Dies wurde zur Reinigung
von Proteinen über Nickel-Chelat-Affinitätschromatografie genutzt, die im tryptophanoperonfreien E. coli KK8-Stamm exprimiert wurden. Die Selektion plasmidtragender E. coli Zellen erfolgt über eine Ampicillin-Resistenz, die durch Expression des β-Lactamase-Gens (bla) ausgeprägt wird.
2.2.5 pDMI,1
Der Vektor pDMI,1 (Certa at al., 1986) ist kommerziell als pREP4-Vektor von der Firma QIAGEN erhältlich. Aufgrund seines konstitutiv exprimierten Repressor-Gens (lacI) ist der pDMI,1-Vektor für die Inhibition des Lac-Promotor/Operatorsystems und damit für die unterdrückte Expression eines in den pQE70- (bzw. pDS56/RBS/SphI) Vektor klonierten Gens in der gleichen Zelle verantwortlich. Eine gezielte Induktion ist durch Zugabe von 0,5 mM IPTG (Endkonzentration) möglich. Der pDMI,1-Vektor besitzt ein p15-Replikon und das Kanamycin-Resistenzgen (kan) als Selektionsmarker.
2.2.6 pCFN1
Der Vektor pCFN1 (Maxwell et al., 1999) wurde so konstruiert, dass ein in die Klonierungsstellen BglII und XbaI eingefügtes Gen mit der stromabwärts kodierten Chloramphenicolacetyltransferase fusioniert wird. N-terminal wird das Fusionsprotein mit einem (His)6-Tag und einem FLAG-Epitop zum Antikörpernachweis versehen.
Zwischen dem Insert und dem cat-Gen liegt ein amber-Stoppcodon (Abbildung 6).
Dadurch ist es möglich, in einem amber-Suppressorstamm (z. B. E. coli JM101; 2.1) das Fusionsprotein herzustellen, während in einem anderen Stamm die Expression nach dem einklonierten Gen abbricht. Der pCFN1-Vektor enthält einen starken, durch IPTG induzierbaren, Promotor Ptrc, pBR322 und Phagen f1 Replikationsursprünge, ein Ampicillinresistenzgen (bla) und ein lacI-Gen.
Abbildung 6: Multiple Klonierungsstelle von pCFN1.
2.2.7 pTNA
Der pTNA-Vektor ist eine Variation des pDS56/RBSII-Vektors (Bujard et al., 1987;
Stüber et al., 1990). Die T5-Promotor und lac-Operator Sequenzen wurden gegen die (-30)–(-10)-Region des Promotors des Tryptophanase-Operons (pTNA) von E. coli ausgetauscht, welcher zu einer schwachen konstitutiven Expression führt (Merz et al., 2000). Die Klonierung erfolgt in der Regel über die SphI- und HindIII-Schnittstellen. Der pTNA-Vektor vermittelt aufgrund der codierten β-Lactamase (bla) Ampicillin-Resistenz. Der Vektor wurde von Prof. Charles Yanofsky (Stanford University, USA) zur Verfügung gestellt.
2.2.8 pHCE-IIB
Der pHCE-IIB Vektor (Abbildung 7) ist ein Derivat des kommerziellen pUC19-Vektors (FERMENTAS). Der induzierbare lacZ-Promotor wurde durch den stark konstitutiv exprimierenden HCE Promotor des D-AAT Gens aus Geobacillus toebii ersetzt (Poo et al., 2002). Dieser ermöglicht im Gegensatz zum pET- oder pQE-System eine Überexpression rekombinanter Proteine ohne Induktion. Die Selektion plasmidtragender E. coli Zellen erfolgt über eine Ampicillin-Resistenz, die durch Expression des β-Lactamase-Gens (bla) ausgeprägt wird.
Der Vektor wurde freundlicherweise von Dr. Moon Hee Sung (BIOLEADERS CORPORATION, Daejeon, Korea) zur Verfügung gestellt.
Abbildung 7: pHCE-IIB-Vektor mit MCS und flankierenden Sequenzen.
Die vollständige MCS setzt sich aus folgenden Restriktionsschnittstellen zusammen: NcoI (223), EcoRI (228), SacI (238), KpnI (244), SmaI (246), BamHI (249), XbaI (255), SalI (261), PstI (271), SphI (277), HindIII (279)
2.2.9 E. coli-Hefe-Shuttle-Vektoren
2.2.9.1 pGAD424
Der E. coli-Hefe-Shuttle-Vektor pGAD424 (6,6 kbp; Bartel et al., 1993) ist ein Beute- (prey) Vektor aus dem CLONTECH Matchmaker yeast-2-hybrid System. Für Klonierungen in E. coli ist eine MCS mit Schnittstellen für verschiedene Restriktionsendonukleasen (EcoRI, SmaI, BamHI, SalI, PstI & BglII), ein ColE1 ori und ein Ampicillinresistenzgen (bla) vorhanden. Das in frame einklonierte Gen wird in S. cerevisiae als Fusionsprotein mit der Gal4-Aktivierungsdomäne (AD) hergestellt und über das Nukleus-Translokationssignal der Alkohol-Dehydrogenase (TADH) in den Zellkern transportiert. Zur Selektion in S. cerevisiae ist ein 2µ ori und das Gen für die 3-Isopropylmalat-Dehydrogenase (leu2) vorhanden, welches leu-defiziente Hefestämme komplementieren kann.
2.2.9.2 pAS2-1
Der E. coli-Hefe-Shuttle-Vektor pAS2-1 (8,4 kbp; Harper et al., 1993) ist ein Köder- (bait) Vektor aus dem CLONTECH Matchmaker yeast-2-hybrid System. Für Klonierungen in E. coli ist eine MCS mit verschiedenen Schnittstellen für Restriktions-endonukleasen (NdeI, NcoI, SfiI, EcoRI, XmaI, SmaI, BamHI, SalI & PstI), ein ColE1 ori und ein Ampicillinresistenzgen (bla) vorhanden. Das in frame einklonierte Gen wird in S. cerevisiae als Fusionsprotein mit der Gal4-DNA-Bindedomäne (DBD) hergestellt und über das Nukleus-Translokationssignal der Alkohol-Dehydrogenase (TADH) in den Zellkern transportiert. Zur Selektion in S. cerevisiae ist ein 2µ ori und das Gen für die Phosphoribosylanthranilat-Isomerase (trp1) vorhanden, welches trp-defiziente Hefestämme komplementieren kann.