Proteinreinigung aus der löslichen Zellfraktion

3.4.2.1 Hitzeschritt

Für folgende Proteine wurde in 10 mM KP, pH 7,5 ein Hitzeschritt wie angegeben durchgeführt:

- HisA und HisA-Varianten: 15 min bei 75 °C - HisF und HisF-Varianten: 20 min bei 75 °C - HisAF-D8V+Y140H+F226E: 15 min bei 60 °C

Durch die anschließende Zentrifugation (Sorvall RC5B plus, SS34 Rotor, 13000 rpm, 30 min, 4 °C) wurden die ausgefallenen Wirtsproteine abgetrennt und das rekombinante Protein aus dem Überstand mittels Nickel-Chelat-Affinitäts-chromatografie weiter angereichert.

3.4.2.2 Metallchelat-Affinitätschromatografie

Die Metallchelat-Affinitätschromatografie wurde mit der Säule HisTrap™ FF crude (GE HEALTHCARE; CV: 5 ml; max. Druck: 0,3 MPa) durchgeführt. Diese Säule besteht aus Sepharose 6 (FastFlow) Medium und dem daran gebundenem Chelator Iminodiaktische Säure (IDA). IDA besitzt sechs Koordinationsstellen, wobei an drei Koordinationsstellen Metallionen (Ni²⁺, Cu²⁺, Co²⁺ oder Fe³⁺) immobilisiert werden können, während die anderen drei zur Komplexierung von Stickstoff- und Schwefelatomen von Histidinen, Tryptophanen oder Cysteinen zur Verfügung stehen. Proteine, die gentechnisch mit einem N- oder C-terminalem (His)6-Tag fusioniert wurden, binden nach Beladung der Säule mit Metallionen (in dieser Arbeit wurde stets Ni²⁺ verwendet) sehr spezifisch an die Säule, da die Metallionen zusätzliche Koordinationsstellen für die Histidine bereitstellen. Die Elution von gebundenem Protein erfolgt durch Anlegung eines Imidazolgradienten, wobei die Imidazolmoleküle mit den chemisch äquivalenten Histidinseitenketten des Proteins

um die Bindestellen an der Säule konkurrieren. In den Auftragspuffern darf sich weder EDTA noch DTT befinden. EDTA würde die gebundenen Nickelionen komplexieren und damit von der Säule entfernen, während DTT die Ionen zu elementarem Nickel reduzieren würde.

Die Beladung der Säule mit Nickelionen erfolgte nach Angaben des Herstellers und wurde bei Bedarf durchgeführt.

Die Reinigung wurde an der Chromatografie-Anlage ÄKTA™ Purifier 10 (GE HEALTHCARE) nach folgender Methode durchgeführt:

Flussrate: 4 ml/min

Equilibrierung: 2 CV Laufpuffer^a

Beladen: 30–60 ml Proteinlösung in 10 mM KP, pH 7,5 Waschen: 5 CV Laufpuffer^a

Eluieren: 15 CV Gradient von 15–500 mM Imidazol mit Elutionspuffer^b; es wurden Fraktionen à 2 ml gesammelt.

Reinigung der Säule: 5 CV Elutionspuffer^b Equilibrierung: 5 CV Laufpuffer^a Spülen und Lagerung

der Säule: 5 CV H2O; 3 CV 20 % Ethanol

a: Wurden Proteine gereinigt, die für enzymkinetische Messungen verwendet werden sollten, wurde folgender Laufpuffer verwendet: 10 mM KP, pH 7,5, 500 mM NaCl, 15 mM Imidazol; ansonsten wurde der entsprechende Puffer mit 50 mM KP, pH 7,5 verwendet.

b: Wurden Proteine gereinigt, die für enzymkinetische Messungen verwendet werden sollten, wurde folgender Elutionspuffer verwendet: 10 mM KP, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 mM Imidazol; ansonsten wurde der entsprechende Puffer mit 50 mM KP, pH 7,5 verwendet.

Die Elution der Proteine wurde über die Messung der Absorption bei 260 und 280 nm verfolgt. Die weitere Analyse der Elutionsfraktionen erfolgte über SDS-PAGE (3.5.2).

Saubere Fraktionen wurden vereinigt und in der Regel gegen 5 l 5 mM KP, pH 7,5 dialysiert, wenn das Protein für enzymkinetische Messungen verwendet werden sollte. Ansonsten erfolgte die Dialyse gegen 50 mM KP, pH 7,5 (3.4.2.5).

Lag das rekombinant hergestellte Protein zu diesem Zeitpunkt noch nicht in genügender Reinheit vor, dann kamen weitere chromatografische Verfahren zum Einsatz.

3.4.2.3 Affinitätschromatografie mittels Blue Sepharose

Als Matrix wurde Blue Sepharose 6 FF (GE HEALTHCARE) verwendet, welches mit dem immobilisierten Liganden Cibacron Blue F3G-A eine breite Palette von NADP⁺- und NAD⁺-bindenden Proteinen bindet. HisA, HisA-Varianten und HisAF-Varianten binden vermutlich aufgrund struktureller Ähnlichkeit ihrer Substrate mit Nukleotiden an die Matrix (Schwander, 1997). Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei selbst gepackte Säulen eingesetzt. Anfangs wurde eine Blue Sepharose 6 FF Säule mit einem Säulenvolumen von 40 ml benutzt und später eine Säule mit 18,5 ml CV (max.

Druck: 0,5 MPa).

Die Reinigung wurde an der Chromatografie-Anlage ÄKTA™ Purifier 10 (GE HEALTHCARE) Anlage nach folgender Methode durchgeführt:

Flussrate: 4 ml/min

Equilibrierung: 2 CV Laufpuffer^a

Beladen: ca. 25 ml Proteinlösung in 10 mM KP, pH 7,5 Waschen: 1,5 CV Laufpuffer^a

Eluieren: 3 CV Gradient von 0–3,5 M NaCl mit Elutionspuffer^b; es wurden Fraktionen à 3 ml gesammelt.

Reinigung der Säule: 2 CV Elutionspuffer^b Equilibrierung: 2 CV Laufpuffer^a Spülen und Lagerung

der Säule: 5 CV H2O; 3 CV 20 % Ethanol

a: 10 mM KP, pH 7,8, 1 mM DTT

b: 10 mM KP, pH 7,8, 1 mM DTT, 3,5 M NaCl

Die Elution der Proteine wurde über die Messung der Absorption bei 260 und 280 nm verfolgt. Die weitere Analyse der Elutionsfraktionen erfolgte über SDS-PAGE (3.5.2).

Saubere Fraktionen wurden vereinigt und gegen 5 l 5 mM KP pH 7,5 dialysiert (3.4.2.5). Meist wurde diese Säule zur weiteren Reinigung von HisAF-Varianten, die enzymkinetisch vermessen werden sollten, im Anschluss an die Nickel-Chelat-Affinitätschromatografie (3.4.2.2) verwendet.

3.4.2.4 Ionenaustauschchromatografie

Die Ionenaustauschchromatografie beruht auf der kompetitiven Wechselwirkung von geladenen Molekülen, wobei Proteine mit Salzionen um die geladenen Positionen

auf einer Ionenaustauschermatrix konkurrieren. Zuerst bindet das geladene Molekül an die fixierten Ladungen des Trägermaterials. Im Anschluss daran erfolgt die Verdrängung und Elution des Proteins entweder durch eine steigende Salzkonzentration oder durch die Änderung des pH-Werts. Die Ladung eines Proteins wird hauptsächlich von den Aminosäuren mit geladenen Seitenketten bestimmt. So sind im sauren und neutralen pH-Bereich die Aminogruppen, überwiegend von Lys, Arg und His, protoniert und das Protein zeigt ein kationisches Verhalten, während im neutralen und basischen Bereich die Carboxygruppen der Seitenketten von Asp und Glu negative Ladungen tragen und somit das Protein als Anion vorliegt. Die Gesamtladung eines Proteins ist deswegen von der Aminosäurezusammensetzung und vom pH-Wert der umgebenden Lösung abhängig. Bei Trägermaterialien, die selbst positive Ladungen aufweisen und Anionen zu binden vermögen, spricht man von Anionenaustauschern, während man bei negativ geladenen Trägermaterialien, welche Kationen binden können, von Kationenaustauschern spricht.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit der Anionenaustauschersäule MonoQ 16/10 (GE HEALTHCARE; CV: 20 ml) gearbeitet.

Die Reinigung wurde an der Chromatografie-Anlage ÄKTA™ Purifier 10 (GE HEALTHCARE) nach folgender Methode durchgeführt:

Flussrate: 4 ml/min

Equilibrierung: 2 CV Laufpuffer^a

Beladen: ca. 35 ml Proteinlösung in 50 mM KP, pH 7,5 Waschen: 10 CV Laufpuffer^a

Eluieren: 15 CV Gradient von 0–1,5 M NaCl mit Elutionspuffer^b; es wurden Fraktionen à 4 ml gesammelt.

Reinigung der Säule: 3 CV Elutionspuffer^b Equilibrierung: 3 CV Laufpuffer^a Spülen und Lagerung

der Säule: 5 CV H2O; 3 CV 20 % Ethanol

a: 50 mM KP, pH 7,5

b: 50 mM KP, pH 7,5, 1,5 M NaCl

Die Elution der Proteine wurde über die Messung der Absorption bei 260 und 280 nm verfolgt. Die weitere Analyse der Elutionsfraktionen erfolgte über SDS-PAGE (3.5.2).

Saubere Fraktionen wurden vereinigt und gegen 5 l 50 mM KP pH 7,5 dialysiert (3.4.2.5). Meist wurde diese Säule zur Reinigung von HisFwt verwendet.

3.4.2.5 Dialyse von Proteinlösungen

Falls bei einer Proteinlösung der Puffer gewechselt oder Salze entfernt werden mussten, wurde gegen einen mindestens 100-fachen Volumenüberschuss des Puffers bei 4 °C im Kühlraum dialysiert. Hierzu wurde ein Dialyseschlauch (Visking) mit einer molekularen Ausschlussgrenze von 14 kDa verwendet, welcher das Protein zurückhält, während niedermolekulare Substanzen die Membran passieren können.

HisA- und HisAF-Varianten, die enzymkinetisch charakterisiert werden sollten, wurden stets zweimal gegen 5 l 5 mM KP, pH 7,5 dialysiert. Wurden diese HisAF-Varianten über zwei Säulen (3.4.2.2 & 3.4.2.3) gereinigt, erfolgte die Dialyse zwischen den beiden Reinigungen gegen 10 mM KP, pH 7,5. Wurde das Protein für andere Charakterisierungen gereinigt, erfolgte die Dialyse gegen 5 l 50 mM KP, pH 7,5.

3.4.2.6 Einkonzentrieren von Proteinlösungen

Die Proteinlösungen wurden mit Hilfe der Amicon^® Zentrifugenröhrchen (Amicon Ultra 4 bzw. 15; molekulare Ausschlussgrenze: je 10 kDa) über eine semipermeable Membran nach Herstellerangaben (Eppendorf Centrifuge 5810R, 4000 rpm, 4 °C) einkonzentriert. Die Dauer der Zentrifugation richtete sich nach dem Volumen des einzukonzentrierenden Proteins.

3.4.2.7 Lagerung von gereinigtem Protein

Die gereinigten und konzentrierten Proteine wurden in flüssigen Stickstoff getropft und bei -80 °C gelagert.