Herstellung  und  Charakterisierung  einer  hisAF‐Genbank  und  anschließendes  in  vivo

Für die Erstellung einer Genbank wurden in hisAF durch epPCR Punktmutationen eingefügt. Als Templat für die Amplifikation wurde pER13a-hisAF mit den genflankierenden Primern 5’pET-NdeI und 3’pER13a-NotI eingesetzt, wobei 0,5 mM MnCl2 und ein unausgeglichenes Verhältnis von dNTPs verwendet wurde (3.3.7.4).

Das Gemisch der hisAF-Mutanten wurde unter Verwendung der Restriktionsschnittstellen NdeI und NotI in pER13a ligiert und zur Transformation von XL1 Blue MRFʼ Zellen verwendet. Die erzeugte hisAF-Genbank umfasste ca. 1,1·10⁶ unabhängige Varianten (3.3.8.1). Durchschnittlich konnte ein Nukleotidaustausch pro hisAF Gensequenz beobachtet werden, wobei 0–3 Nukleotidaustausche pro Gen auftraten. Der Wert für das Verhältnis von Ts/Tv betrug 2,2, was auf eine ausgeglichene Mutationsverteilung hinweist. Obwohl die Mutationsfrequenz mit durchschnittlich einem Nukleotidaustausch pro Gen gering ausfiel, wurde mit dieser Genbank ein in vivo Screening durchgeführt, da bei vergleichbaren Arbeiten zur Verbesserung der Stabilität und Löslichkeit von HisF-C*C ein bis zwei Austausche ausgereicht haben, um einen deutlichen Effekt zu erzielen (Seitz et al., 2007).

Durch die zufällige Mutagenese von hisAF sollten Mutationen eingefügt werden, die die Löslichkeitseigenschaften von HisAF positiv beeinflussen. Es wurde erwartet, dass diese Varianten bei einer FACS-Analyse höhere Fluoreszenzintensitäten aufweisen (vgl. Abbildung 26). Um für die jeweilige Sortierung den Screening-Bereich zu ermitteln, wurde jeweils vor der präparativen Sortierung eine FACS-Analyse mit 3·10⁵ Zellen durchgeführt. Die in den folgenden Abbildungen gezeigten Diagramme zeigen in der Regel diesen vorgeschalteten analytischen Schritt, dessen Ergebnis stets dem der präparativen Sortierung entsprach.

Bei dem im Folgenden dargestellten in vivo Screening im FACS mit der erstellten pER13-hisAF Genbank und E. coli Rosetta(DE3)pLysS Zellen wurden insgesamt fünf Anreicherungsrunden durchgeführt. Nach jeder Runde wurden die heraussortierten

Zellen mit LB-Medium versetzt und über Nacht bei 37 °C in 5 ml LBKan-Medium angezogen. Daraus wurden für die folgende Anreicherungsrunde Zellen entnommen, um eine frische 5 ml LBKan-Kultur auf OD600 = 0,1 anzuimpfen. Diese wurde bei 0,6 ≤ OD600 ≤ 0,8 mit 0,5 mM IPTG induziert und für 4 h bei 37 °C inkubiert.

Anschließend wurde 1 ml der Zellkultur abgenommen, mit 1x PBS gewaschen, im gleichen Volumen dieses Puffers resuspendiert und zur Sortierung verwendet. Am FACS-Gerät wurde ein Screening-Bereich zwischen 7·10² und 1·10³ relativen Fluoreszenzeinheiten festgelegt. Ab der dritten Anreicherungsrunde konnten bei der Sortierung mehr als 1·10⁶ Zellen im definierten Screening-Bereich aufgefangen werden. Mit diesen wurde ein sog. „Resort“ durchgeführt, das heißt, diese Zellen wurden nach Heraussortierung ohne erneutes Anwachsen einer zweiten Sortierung unterzogen. Eine Übersicht über die einzelnen Anreicherungsrunden gibt Tabelle 7.

Tabelle 7: Übersicht über die FACS-basierte Anreicherung von E. coli Rosetta(DE3)pLysS Zellen mit der hisAF-Genbank.

a: Von diesen beiden „Resorts“ wurden einzelne Zellen auf LB_Kan-Agarplatten vereinzelt: Vom Resort der 4. Anreicherungsrunde waren dies 156 Zellen, vom Resort der 5. Anreicherungsrunde 208 Zellen.

In Abbildung 29A sind die zugehörigen analytischen FACS-Histogramme der Anreicherungsrunden eins, drei und fünf dargestellt. Abbildung 29B zeigt die fünfte Anreicherungsrunde mit dem anschließenden „Resort“, aus dem E. coli Zellen auf LBKan-Agarplatten vereinzelt wurden.

Abbildung 29: Analytische FACS-Histogramme der Anreicherungsrunden 1, 3 und 5 der hisAF-Genbank (A) und Anreicherungsrunde 5 mit anschließendem „Resort“ (B).

Schwarz: HisAF-GFP; rot: hisAF-Genbank-GFP/1. Runde; blau: 3. Runde; grün: 5. Runde; cyan:

„Resort“ nach 5. Anreicherungsrunde; SB: Screening-Bereich. Für jedes Histogramm wurden 3·10⁵ Zellen gezählt. Dass das Maximum der E. coli Zellen mit HisAF-GFP im Vergleich zu Abbildung 26 zu einer höheren Fluoreszenzintensität verschoben ist, ist durch unterschiedliche Kalibrierungen des FACS-Geräts begründet.

Die Ergebnisse aus Tabelle 7 und Abbildung 29 entsprechen den Erwartungen für ein in vivo Screening einer Genbank. Es wurde beobachtet, dass der prozentuale Anteil der Zellen, die ein Fluoreszenzsignal im Screening-Bereich produzieren, mit jeder Anreicherungsrunde stetig zunahm, sodass ab der dritten Anreicherungsrunde jeweils ein „Resort“ möglich war. Insgesamt hat sich der prozentuale Anteil der im Screening-Bereich detektierten Zellen von 0,13 % für die erste Sortierungsrunde auf 55,5 % für den Resort der fünften Sortierungsrunde erhöht.

Mit den auf LBKan-Agarplatten vereinzelten Zellen wurde nach Inkubation bei 37 °C üN eine Kolonie-PCR durchgeführt (3.3.6), um auf DNA-Ebene das Vorliegen des vollständigen hisAF-Gens zu überprüfen. Es wurden jeweils 20 Kolonien des

„Resorts“ der vierten und fünften Anreicherungsrunde mittels Kolonie-PCR untersucht. Dazu wurden zwei Primer verwendet (5ʼT7 Promotor und 3ʼGFPdown), die sich jeweils ca. 70 bp ober- bzw. unterhalb des hisAF-Gens anlagern (Abbildung 30).

Abbildung 30: Analyse der Sortierung der hisAF-Genbank mittels Kolonie-PCR am Beispiel von jeweils 20 zufällig ausgewählten Kolonien aus dem „Resort“ der vierten und fünften Anreicherung (1%iges Agarosegel).

Die erwartete Größe des Amplifikationsprodukts liegt bei ca. 900 bp (Amplifikation mit 5ʼT7P und 3ʼGFPdown), welches alle analysierten Klone zeigen. M: DNA-Längenstandard GeneRuler 1 kb Plus

Aufgrund des Ergebnisses der Kolonie-PCR (Abbildung 30) konnte davon ausgegangen werden, dass die isolierten Zellen das vollständige HisAF-GFP-Fusionsprotein exprimierten. Um dies zu überprüfen, wurden Expressionen im analytischen Maßstab mit zehn Klonen der Kolonie-PCR durchgeführt (Abbildung 31).

Abbildung 31: SDS-PAGE Analyse von zehn zufällig ausgewählten Klonen der in Abbildung 30 dokumentierten Kolonie-PCR.

Das SDS-Gel (12,5 % Polyacrylamid) zeigt die unlöslichen (P) und die löslichen (C) Zellfraktionen der Klone #1 bis #10 aus einer Expression im analytischen Maßstab. M: Markerproteine mit molekularer Masse in kDa. Die Proteinexpression wurde durch 0,5 mM IPTG induziert.

Entgegen der Erwartung eines Fusionsproteins bestehend aus HisAF und GFP bei ca. 55 kDa, erkennt man in Abbildung 31 dominante Banden in der unlöslichen Fraktion bei ca. 25 kDa (schwarzer Pfeil) und in der löslichen Fraktion bei ca. 30 kDa (grüner Pfeil). Daraufhin wurde von vier der 40 mittels Kolonie-PCR untersuchten Klone das pER13a-Plasmid durch eine DNA-Präparation aus den E. coli Rosetta(DE3)pLysS Zellen isoliert und das enthaltende hisAF-Gen vollständig sequenziert. Drei der vier Sequenzen zeigten eine Deletion der Base G613 (Glu205), eine Sequenz zeigte die Deletion der Base C582 (Pro194). Der in beiden Fällen resultierende Frameshift führt zu einem TGA-Stoppcodon an Position 691.

Bemerkenswerterweise findet man in drei der vier Sequenzen zusätzlich die Mutation G690A, wodurch ein ATG-Startcodon entsteht. Das heißt, dass die Basenabfolge TG an dieser Stelle – abhängig vom Frame – sowohl Teil eines Start- als auch eines Stoppcodon ist (Abbildung 32).

hisAF 5‘-ATC GAC GTG AGA GAA-3‘

hisAF_del 5‘-A TCG ACA TGA GAG AA-3‘

Abbildung 32: Sequenzausschnitt des hisAF-Gens von Base 685 bis 699.

Lücken stellen den Leserahmen dar. hisAF_del: Durch Basendeletion an Position C582 bzw. G613 verursachter Frameshift, welcher zu einem TGA-Stoppcodon (unterstrichen) führt; fett: Codon für V231; grün: Mutation G691A, die zu einem ATG-Startcodon führt.

Sollte bei den im FACS-Screening gefundenen Varianten die Translation des hisAF-Gens am durch die Basendeletion entstandenen Codon V231 abbrechen, gleichzeitig aber die Translation am entstandenen ATG-Startcodon neu beginnen, würden an HisAF C-terminal 20 Aminosäuren (2,4 kDa) fehlen, die an GFP N-terminal zusätzlich vorhanden wären. In Abbildung 31 wird genau das beobachtet. Die Bande in der löslichen Zellfraktion (grüner Pfeil) entspricht dem 28 kDa großen GFP mit den zusätzlichen 20 Aminosäuren von HisAF, während die Bande bei 25 kDa (schwarzer Pfeil) HisAF ohne die 20 Aminosäuren darstellt. Abschließend wurde überprüft, ob die lösliche Zellfraktion der zehn in der Probeexpression verwendeten Klone eine stärkere Fluoreszenzintensität zeigt, als die lösliche Fraktion von Zellen, die HisAF-GFP heterolog exprimieren (Abbildung 28). Dazu wurde der lösliche Überstand der zehn Klone im Fluorimeter vermessen. Dabei zeigten alle Klone eine GFP-Fluoreszenz zwischen 800 und 1000 relativen GFP-Fluoreszenzeinheiten (Daten nicht gezeigt) und lagen somit wesentlich über der von HisAF-GFP (Abbildung 28 und Abbildung 35).

Somit kann zusammenfassend festgehalten werden, dass das FACS-Screening zur Isolierung stärker fluoreszierender Zellen geführt hat. Bei der Analyse der gefundenen hisAF-Mutanten wurde jedoch festgestellt, dass es sich dabei um falsch-positive Klone handelt, da diese Zellen statt des erwarteten HisAF-GFP-Fusionsproteins isoliertes GFP heterolog exprimierten. Die Ursache für die beobachteten Basendeletionen in hisAF und dem daraus resultierenden Translationsstopp bzw. Neustart ist unklar.

Da in früheren Arbeiten positive Ergebnisse erzielt werden konnten, wenn nur eine Genhälfte randomisiert vorlag (Seitz et al., 2007), sollte ein entsprechender Ansatz für HisAF durchgeführt werden. Dazu wurde der HisA-Teil von HisAF randomisiert und aus Klonierungsgründen (siehe nächstes Kapitel) über einen GlySerGly-Linker mit dem unveränderten HisF-Teil von HisAF verbunden werden. Höcker (2002) konnte zeigen, dass der GlySerGly-Linker keinen Einfluss auf die biophysikalischen Eigenschaften von HisAF hat.

4.3.2.2 Herstellung und Charakterisierung einer hisArandF-Genbank und