Vergleich der Substanzen

Generell konnte bei allen Funktionalisierungssubstanzen die Anbindung auf der Ma-gnetitoberfläche nachgewiesen werden, was durch neu auftretende Banden im FTIR-Spektrum der funktionalisierten Partikel belegt wurde. Weiterhin wurden in allen funk-tionalisierten Proben die charakteristischen Banden von Magnetit detektiert. Bei allen Substanzen, bei denen eine pH-Wertabhängigkeit besteht, lässt sich eine bevorzug-te Anbindung bei einem pH-Wert von 7 festsbevorzug-tellen, was auf die Lage des IEPs von Magnetit zurückzuführen ist. Ein Vergleich der adsorbierten Mengen der Funktiona-lisierungssubstanzen ist aufgrund der unterschiedlichen Bandenintensitäten der Rein-stoffe schwierig. Jedoch ist auffällig, dass die Absorptionsintensitäten in den FTIR-Spektren aller Funktionalisierungssubstanzen im gleichen Bereich liegen, was auf eine Limitierung der Bindungsstellen hindeutet und eine spezifische Adsorption wahrschein-lich macht. Dennoch ist die Intensität der neu auftretenden Banden sehr gering. Mit der theoretischen Berechnung (vgl. Kapitel 3.3) würde die eingesetzte Konzentrati-on der funktiKonzentrati-onalisierten Substanzen für eine Absättigung der Hydroxylgruppen an der Magnetitoberfläche ausreichen. Jedoch würde dies bei einer molaren Masse von 200 g·mol⁻¹ eine Beladung von 5 mgfunkt.Substanz·mg_Fe⁻¹

3O4 bedeuten, was zu höheren Intensitäten der Bande führen müsste, wenn man sie mit den Schwingungsbanden der Reinstoffe vergleicht. Dennoch ist zu berücksichtigen, dass die FTIR-Spektren der an-gebundenen Funktionalisierungssubstanz beeinflusst werden, da das Molekül durch die Bindung veränderte Schwingungsfreiheitsgrade besitzt. Folglich müsste die Sättigungs-konzentration bzw. der Einfluss der Funktionalisierungszeit in weiteren Experimenten untersucht werden.

Eine Aussage über die Bindungsstabilität der funktionalisierenden Substanzen an der Magnetitpartikeloberfläche lässt sich anhand der Proteinbestimmung nach Bradford treffen. Durch Störungen im Testsystem wird auf die Existenz der funktionalisierenden Substanzen im Überstand bei der Proteinbestimmung geschlossen, die sich während der Immobilisierung abgelöst haben. Diese Beobachtungen werden bei einer Funktio-nalisierung mit Benzo- und Hydrochinon und Gallussäure gemacht. Es ist möglich, dass Funktionalisierungssubstanzen aufgrund unzulänglicher Waschung im Überstand verblieben sind. Dem widersprechen allerdings die Ergebnisse der Funktionalisierungs-substanzen DOPA, Dopamin und Kaffeesäure, bei denen diese Störung des Tests nicht detektiert werden konnte. Daher wird bei der letzteren Gruppe von einer stabileren Bindung ausgegangen.

Die unterschiedlichen Bindungsstabilitäten der Funktionalisierungssubstanzen lassen die Annahme unterschiedlicher Bindungsmechanismen zu. Bei den Substanzen Hydro-und Benzochinon sind die Hydroxylgruppen in para-Stellung positioniert, weshalb eine

5.1. FUNKTIONALISIERUNG 107

Komplexierung über beide Hydroxylgruppen sterisch nicht möglich ist [235]. Die FTIR-Spektren weisen auch darauf hin, dass nur eine Hydroxylgruppe am Bindungsprozess beteiligt ist. Weiterhin könnten auch für die instabilen Bindungen Wasserstoffbrücken und unspezifische Adsorption verantwortlich sein. Die Erkenntnis über die unterschied-lichen Bindungsstabilitäten zeigt, dass anscheinend die phenolischen Substanzen mit zwei Hydroxylgruppen in ortho-Stellung (DOPA, DA, CA) eine zweizähnige Bindung eingehen, welche im Gegensatz zu einer einzähnigen Bindung stabiler ist.

Bei Gallussäure wird ein anderer Grund für die Instabilität der Bindung angenommen.

Sie besitzt insgesamt drei Hydroxylgruppen am aromatischen Ring, welche in ortho-und meta-Stellung angeordnet sind. Diese Anordnung führt zu sterischen Wechselwir-kungen zwischen den einzelnen Molekülen und der Magnetitoberfläche und so zu einer Hemmung/Störung bei der Anbindung.

Zusätzlich zur Lage der Hydroxylgruppen am aromatischen Ring sind die Polarität und Dissoziation der funktionellen Gruppen der Funktionalisierungssubstanzen von Bedeu-tung bei der Anbindung. Für den Anionenaustauschprozess der Eisenionen mit den Endiolgruppen der funktionalisierenden Substanz muss die gebundene Hydroxidgrup-pe oder gebundenes Wasser an Eisenionen vorher abgegeben werden, was durch einen saurern pH-Wert erleichtert wird.

Im basischen pH-Bereich wird von einer niedrigeren Adsorption organischer Verbindun-gen ausgeganVerbindun-gen [14, 95], da die Moleküle negativ geladen sind, sich dadurch geVerbindun-genseitig elektrostatisch abstoßen und somit die Adsorption behindern. Dies wurde in der Regel bei allen untersuchten Substanzen bestätigt, mit der Ausnahme des Dopamins, das eine ähnliche Anbindung im Neutralen und Basischen erzielte. Dieses Phänomen wird durch die Eigenschaften der Cyclisierung von Dopamin begründet.

Die unterschiedlichen Bindungsaffinitäten können in den unterschiedlichen Säurekon-stanten der Hydroxylgruppen begründet sein. Dabei eignen sich diejenigen Moleküle am besten, bei denen die Dissoziationskonstante im Bereich des IEP der Oberfläche liegt [14, 112]. Der pH-Wert hat nicht nur Einfluss auf die Dissoziation der funktio-nellen Gruppen, sondern auch auf den Oxidationszustand der phenolischen Substanz.

Das Redoxgleichgewicht bei hohen pH-Werten liegt auf der Seite der Chinone und wird durch die Lage, Art und Anzahl der Substituenten beeinflusst [137]. Dieses Gleichge-wicht spielt eine Gleichge-wichtige Rolle in der Anbindung und es ist fraglich, ob die in der Theorie beschriebene Anbindung mit Chinonverbindungen stattfinden kann oder ob es eher zu einer nucleophilen Substitution kommt (vgl. Kapitel 2.4.3.1).

Zusätzlich zu den sterischen Effekten verfügen die substituierten funktionellen Gruppen am aromatischen Ring über verschiedene Einflüsse in der Reaktivität aufgrund ihrer induktiven Effekte und Mesomerieeffekte. Dabei besitzen die Hydroxylgruppen einen negativen induktiven sowie positiven mesomeren Effekt. Dagegen weisen Kaffeesäure und Gallussäure eine Säuregruppe auf, welche über einen negativen mesomeren Effekt verfügt. Im Unterschied dazu besitzen die Aminogruppen wie z.B. bei DOPA und Do-pamin einen positiven mesomeren Effekt [137]. Durch die Art der Substituenten wird die Elektronendichteverteilung in organischen Molekülen beeinflusst, was

Auswirkun-gen auf deren Reaktionsverhalten hat [134]. Dennoch überwieAuswirkun-gen die sterischen Effekte im Vergleich zu den induktiven Effekten und Mesomerieeffekten, was an den Ergeb-nissen der Kaffeesäure und Gallussäure erkenntlich wird. Weiterhin haben Araujo et al. gezeigt, dass die Bindungsaffinität von Brenzkatechin und seiner Derivate von der Azidität abhängt [253] und dass durch Einführung elektronegativer Gruppen, wie z.B.

einer N O₂-Gruppe in das Brenzkatechinmolekül, die elektrostatischen Wechselwirkun-gen zwischen den Molekülen und Eisenoxiden zunehmen, was auf die Erniedrigung der pK_s-Werte zurückzuführen ist [112].

Die Funktionalisierung erhöht in der Regel die Suspensionsstabilität mit Ausnahme von Dopamin. Diese Erkenntnisse basieren auf den Messungen des Zetapotentials sowie der Betrachtung von REM-Aufnahmen. Beim Vergleich der Zetapotentialmessungen von DOPA, CA, und BQ ist eine Verschiebung des IEPs erkenntlich, welcher nach der Funktionalisierung bei einem pH-Wert von ca. 4 liegt. Vergleicht man die Beträge der Zetapotentiale untereinander, ist eine Reihenfolge der Suspensionsstabilität erkennbar.

Die besten Ergebnisse liefert CA gefolgt von DOPA und BQ.

Es wurde kein Auftreten zusätzlicher Peaks sowie keine Peakverschiebungen in den Röntgenbeugungsspektren detektiert. Daraus lässt sich folgern, dass die Funktionali-sierung einen geringen Einfluss auf die Kristallgitterstruktur hat. Eine Veränderung der Kristalloberfläche durch Oxidation kann nicht gänzlich ausgeschlossen werden, die Gitterkonstante und die Partikelgröße sind aber nach der Funktionalisierung nahezu identisch. Ähnliche Beobachtungen wurden auch von Mohapatra et al. gemacht [81].

Vergleicht man die Ergebnisse der Immobilisierung untereinander, fällt auf, dass gene-rell eine erhöhte Proteinbeladung bei einem pH-Wert der Immobilisierung von 5,7 er-reicht wird. Zusätzlich treten bei allen immobilisierten und funktionalisierten Partikeln die charakteristischen Banden des Magnetits auf. Trotzdem zeigen sich Unterschiede bei den verschieden Substanzen. Die funktionalisierten Partikel mit den Substanzen mit zwei Hydroxylgruppen in ortho-Stellung (CA, DOPA) weisen im Vergleich zu den unfunktionalisierten Partikeln ca. die doppelte Proteinbeladung bei einem pH-Wert von 5,7 auf, wenn die vorangegangene Funktionalisierung im neutralen bis sauren pH-Bereich durchgeführt wurde. Dagegen weisen die Partikel, die mit Substanzen mit zwei Hydroxylgruppen in para-Stellung (BQ, HQ) bzw. mit drei Hydroxylgruppen (GA) am aromatischen Ring funktionalisiert wurden, geringere Beladungen auf.

Die unterschiedlichen Proteinbeladungen der verschiedenen Moleküle und des unfunk-tionalisierten Magnetits können durch die unterschiedliche Reaktivität der Funktiona-lisierungssubstanzen bzw. des Magnetits mit dem Protein erklärt werden. Falls eine Proteinanbindung des funktionalisierten Magnetits über die freien funktionellen Grup-pen stattfindet, sind die unterschiedlichen Reaktivitäten der funktionellen GrupGrup-pen ausschlaggebend und führen zu unterschiedlichen Beladungen. Die Sättigung der Ober-fläche mit den funktionalisierten Molekülen hat eine Bedeutung für den Anbindungs-mechanismus und man kann von einer Bindung zwischen funktioneller Gruppe und dem Protein bei einer vollständigen Bedeckung ausgehen. Weiterhin werden die Ladungsei-genschaften der Partikeloberfläche durch die Funktionalisierung beeinflusst, was eben-falls einen Einfluss auf die Proteinanbindung hat. Die höchste Proteinbeladung wiesen

5.1. FUNKTIONALISIERUNG 109

mit CA funktionalisierte Partikel auf, bei denen die Funktionalisierung in einem pH-Bereich von 4-7 stattgefunden hat.

Zusätzlich zu den bereits oben erwähnten Einflussmöglichkeiten auf die Proteinbela-dung kann durch die Funktionalisierung der Partikel die Suspensionsstabilität erhöht werden, was einen geringeren Agglomerationsgrad zur Folge hat, so dass sich die spezifi-sche Partikeloberfläche vergrößert und es zu einer vermehrten Proteinbeladung kommt.

Weiterhin sind Unterschiede in der Proteinbeladung von CA, DA und DOPA erkennt-lich, was durch die unterschiedliche Affinität der funktionellen Gruppen von Funktio-nalisierungssubstanz und Protein begründet wird. Dabei muss beachtet werden, dass bei den erhöhten Proteinbeladungen sowohl CA als auch DOPA gut an die Magnetit-oberfläche angebunden haben, wogegen sich bei Dopamin ein gegensätzlicher Verlauf zeigt (vgl. Kapitel 5.1.3.1). Vergleicht man die Proteinbeladung von CA und DOPA, ist erkenntlich, dass die direkte Proteinanbindung im Vergleich besser über die funk-tionelle Carboxylgruppe als über die Amino- bzw. Carbonlygruppe in DOPA verläuft, falls eine vollständige Beschichtung vorliegt. Daher wird auf eine höhere Affinität der Carboxylgruppe von Kaffeesäure im Vergleich zur Amino- und Carbonylgruppe von DOPA geschlossen. Eine geringere Proteinbeladung im Vergleich zum unfunktionali-sierten Partikel wurde bei den Molekülen BQ, HQ und GA detektiert. Auffällig ist, dass bei all diesen Substanzen eine geringere Bindungsstabilität auftritt. Daher kann es durch die Anbindung der Proteine an die Funktionalisierungssubstanz und anschlie-ßendes Ablösen zu einer geringeren Beladung kommen.

Ein Einfluss der Kettenlänge der funktionellen Gruppen auf die Funktionalisierung ist schwierig festzustellen, da die Gallussäure die kürzeste Kettenlänge aufweist und nicht über den gleichen Bindungsmechanismus wie die Substanzen mit zwei Hydroxyl-gruppen in para-Stellung verfügt (vgl. Kapitel 5.1.3.3). Die Kettenlängen von CA und DOPA sind ähnlich. DA neigt zur Cyclisierung. Deshalb können die Substanzen nicht verglichen werden. Falls die Proteinbindung an der funktionellen Gruppe stattfindet, ist eine längere Kette vorteilhaft. Dadurch wird die sterische Hinderung zwischen den Proteinen untereinander vermindert. Zusätzlich spielt die flexiblere Lage des Proteins zum Träger eine Rolle für die Aktivität [159, 255].

Generell wird durch die Immobilisierung des Proteins BSA die Suspensionsstabilität im Vergleich zu den funktionalisierten Partikeln verringert. Dabei geht mit der Zunah-me der Proteinbeladung eine Verringerung der Suspensionsstabilität einher, was eine Agglomeration der Partikel fördert. Diese führt bei den Substanzen CA und DOPA zu einer Erhöhung des IEP nach der BSA-Immobilisierung, was auf die Anbindung von BSA und dessen IEP zurückzuführen ist. Auch eine Strukturveränderung des Trä-germaterials nach der Immobilisierung basierend auf den Ergebnissen der Röntgen-beugungsspektren ist auszuschließen. Auffällig bei der Proteinanbindung ist bei allen Substanzen der neu auftretende Peak in niedrigen Winkelbereichen, der durch die BSA-Anbindung hervorgerufen wird.

Basierend auf diesen Ergebnissen wurden CA und DOPA aufgrund ihrer größeren Bin-dungsstabilität und der hohen Proteinbeladung, welche durch die Funktionalisierung hervorgerufen wird, weiter hinsichtlich ihrer Einflussfaktoren wie Ionenkonzentration,

Versuchszeit und Temperatur untersucht. Außerdem ist der Einfluss der Anbindung weiterer unterschiedlicher Substanzen mit unterschiedlicher Länge der funktionellen Substanz (Spacerwirkung) an Magnetit von Interesse, gerade in Hinblick auf die Im-mobilisierung aktiver Proteine. Ein weiterer interessanter Aspekt ist die Funktionalisie-rung unterschiedlicher Magnetite sowie die simultane FunktionalisieFunktionalisie-rung und Synthese magnetischer Trägermaterialien. Diese Aspekte sollen in den nächsten Kapitel disku-tiert werden.