Einfluss der Funktionalisierungssubstanz auf die BSA-AnbindungBSA-Anbindung

Um erste Abschätzungen über die Immobilisierung an den funktionalisierten Magnetit-partikeln machen zu können, wurde das Standardprotein BSA verwendet. In Abbildung 5.61 sind die FTIR-Spektren der mit CA (a) und DOPA (b) funktionalisierten und pro-teinbehafteten Partikeln in Abhängigkeit der Zeit dargestellt. Bei den FTIR-Spektren ist sofort die BSA charakteristische Doppelbande bei 1650 cm⁻¹ und 1541 cm⁻¹ zu erkennen. Diese Banden stehen für die Amidschwingungen I und II, wobei die erste hauptsächlich durch C=O-Dehnungsschwingungen und die zweite durch die Kombi-nation von Biegeschwingungen der N-H-Moleküle und Dehnungsschwingungen der C-N-Schwingungen auftritt. Weiterhin ist eine breite Bande im Wellenzahlenbereich von 3400−3000 cm⁻¹ erkennbar. Diese breite Bande setzt sich aus den Dehnungsschwingun-gen der OH-Gruppen sowie den AmiddehnungsschwingunDehnungsschwingun-gen zusammen [134, 205, 238].

Da diese Schwingungsbande durch die Anregung mit infrarotem Licht erzeugt werden, kann von einer Bindung des BSAs an beiden funktionalisierten Partikeln ausgegan-gen werden. Weiterhin ist eine zusätzliche Bande bei den mit CA funktionalisierten Partikeln (vgl. Abb. 5.61 (a)) bei einer Wellenlänge von 1296 cm⁻¹ erkennbar. Diese Schwingung resultiert von der Kaffeesäure und steht für C-H-Schwingungen oder Ph-O-Schwingungen des aromatischen Ringes. Diese Schwingung ist bei den mit DOPA funktionalisierten und BSA immobilisierten Partikeln (vgl. Abb. 5.61 (b)) nicht so aus-geprägt zu erkennen. Wenn Schwingungen von der Kaffeesäure emittiert werden, ist es nicht zu einer vollständigen Oberflächenbedeckung mit BSA gekommen, da andernfalls die Schwingungen der CA von der BSA-Hülle überlagert werden.

Bei den Intensitäten der Doppelbande bei1650 cm⁻¹ist keine direkte Abhängigkeit von der Funktionalisierungszeit erkennbar. So zeigt sich, dass bei mit DOPA funktionali-sierten Partikeln die Bandenhöhe z.B. nach 3 h leicht höher ist als die von 6 h. Bei der Kaffeesäure zeigt sich ein ähnliches Bild. Hier sind die Bandenintensitäten nach 20 h Funktionalisierungszeit geringer als nach 3 h, so dass hier kein Zusammenhang zwischen der Immobilisierungszeit und der BSA-Beladung ersichtlich wird. Diese Beobachtun-gen zeiBeobachtun-gen sich auch in der Messung der Zetapotentialverläufe (vgl. Abb. 5.62). Die Partikelsuspensionen haben ein Zetapotential bei pH 7 im Bereich von |14| − |23|mV, was nicht ausreichend hoch für eine stabile Partikelsuspension ist. Die Suspensions-stabilität der BSA beladenen Partikel liegt zwischen den Stabilitätswerten reinen und funktionalisierten Magnetits.

Die Agglomeratdichteverteilung funktionalisierter und immobilisierter Partikel bestärkt die Aussage der niedrigeren Suspensionsstabilität, da größere Agglomerate nach der Im-mobilisierung vorhanden sind. Jedoch wurde die initialen Agglomeratgrößen der reinen Magnetitproben nicht wieder erreicht.

5.1. FUNKTIONALISIERUNG 143

2600

Wellenzahl [cm

]

0,00

Abbildung 5.61:FTIR-Spektren CA und DOPA funktionalisierter und BSA immobilisierter Magne-titpartikel in Abhängigkeit der Immobilisierungszeit. Funktionalisierung erfolgte 24 h in5,2 mmol·l⁻¹ CA/DOPA-Lösung bei pH 7 in 0,01 mol·l⁻¹ Trispuffer. Immobilisierung fand im 0,1 mol·l⁻¹ EA-Puffer bei pH 5,7 mit einer BSA-Konzentration von1 mg·ml⁻¹ statt. Magnetitkonzentration betrug 1,2 mg·ml⁻¹.

Die mit DOPA funktionalisierten und BSA beladenen Partikel haben ähnliche Ergeb-nisse erzielt und die IEP liegen auch im Bereich des reinen BSAs (vgl. Kapitel 3.1.4).

Wie auch bei den mit CA funktionalisierten und BSA immobilisierten Nanopartikeln liegen die IEP zwischen denen der unbehandelten Magnetite (Mi) und denen der funk-tionalisierten Partikel. Diese Unabhängigkeit der Immobilisierungsdauer wird auch in Abbildung 5.63 (a) ersichtlich, da keine höhere Proteinbeladung mit steigenden Immo-bilisierungszeit erreicht wird.

-50

Abbildung 5.62: Zetapotentialverläufe CA funktionalisierter und BSA immobilisierter Magnetit-partikel in Abhängigkeit der Immobilisierungszeit. Funktionalisierung erfolgte in 5,2 mmol·l⁻¹ CA-Lösung bei pH 7 in0,01 mol·l⁻¹ Trispuffer. Immobilisierung fand im0,1 mol·l⁻¹EA-Puffer bei pH 5,7 mit einer BSA-Konzentration von 1 mg·ml⁻¹ statt. Magnetitkonzentration betrug1,2 mg·ml⁻¹.

Zusätzlich ist zu erkennen, dass die Proteinbeladung der zwei unterschiedlich funktio-nalisierten Partikel in etwa identisch ist. Sie liegt für die mit CA funktiofunktio-nalisierten Partikeln bei 0,59±0,03−0,67±0,01 mg_BSA·mg⁻¹_Fe

3O4 und bei den mit DOPA be-handelten zwischen0,60±0,02−0,70±0,01 mg_BSA·mg⁻¹_Fe

3O4. Es handelt sich um eine unspezifische Sorption, da sie sehr schnell abläuft [260].

Diese Vermutung wird durch die BSA-Beladung in Abhängigkeit der initialen Protein-konzentration bestärkt, welche in Abbildung 5.63 (b) zu sehen ist. In dieser Abbildung ist erkenntlich, dass die BSA-Beladung mit steigender Anfangskonzentration zunimmt, ohne eine ersichtlich Sättigung zu erreichen. Dieses Phänomen wird bei beiden Funktio-nalisierungssubstanzen beobachtet und deutet auf eine mehrschichtige Anbindung hin.

Bei den mit DOPA funktionalisierten und BSA immobilisierten Partikel steigt die Pro-teinbeladung von0,10±0,02 mg_BSA·mg_Fe⁻¹

3O4 bei einer BSA-Anfangskonzentration von 0,1 mg·ml⁻¹auf3,84±0,01 mg_BSA·mg⁻¹_Fe

3O4 bei einer anfänglichen Konzentration von 5 mg·ml⁻¹. Die IEP dieser Versuchsreihe liegen alle auf gleichem Niveau (nicht gezeig-te Dagezeig-ten), da die Oberfläche schon vollständig bedeckt ist und somit keinen weigezeig-teren Einfluss hat. Dieses unterstreicht ebenfalls eine mehrschichtige Anbindung [113, 260].

Insgesamt kann festgestellt werden, dass eine Proteinadsorption mit BSA an den funk-tionalisierten Partikeln möglich ist und hohe Beladungen erreicht werden. Es wird von einer nicht spezifischen Adsorption ausgegangen, was in Hinblick auf eine Enzym-immobilisierung zu niedrigeren Enzymaktivitäten und einer niedrigeren Stabilität des Enzym-Trägerkomplexes führen könnte. Deshalb werden bei der Enzymimmobilisierung die funktionellen Gruppen des Trägermaterials mit bereits aus der Enzymimmobilisie-rung (vgl. Kapitel 2.5.1) bekannten Verfahren aktiviert, so dass sich eine kovalente Bindung zwischen Enzym und funktionalisiertem Träger ausbilden kann.