Enzymimmobilisierungen an magnetischen Trägern

Der Einsatz magnetischer Trägermaterialien zum Zwecke der Immobilisierung wird erstmals 1973 erwähnt [31]. Heute ist es bereits gelungen, einige bioaktive Substanzen

wie Enzyme, Antikörper, Proteine oder Medikamente an Magnetit zu binden, wobei üblicherweise eine Polymerbeschichtung (vgl. Kapitel 2.4.2.1) vorgenommen wird [10].

Zusätzlich zu den Polymerbeschichtungen werden auch Silanbeschichtungen (vgl. Ka-pitel 2.4.2.3) und Direktimmobilisierungen durchgeführt, worauf im Folgenden kurz eingegangen wird.

Schultz et al. [4, 8] haben magnetische Polyvinylalkoholpartikel (M-PVA) mit Epoxy-, Carboxyl- und Aminogruppen funktionalisiert, wobei der Gehalt des magnetischen Ma-terials bei ca. 50-60 % lag. Die carboxyl- und aminofunktionalisierten Partikel wur-den mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) und Glutaraldehyd für die Immobilisierung ak-tiviert. Als Enzyme wurden die Lipasen Candida rugosa Typ A und B verwendet.

Dabei stellte sich heraus, dass die epoxyaktivierten Partikel mit Candida rugosa Typ A die besten Ergebnisse mit einer Aktivität EAk von 733 U·g⁻¹_Partikel erzielten, gefolgt von den aminofunktionalisierten Partikeln mit233 U·g⁻¹_Partikel. Die Immobilisierung der zweiten Lipase des Typs B verfügte über schlechtere Ergebnisse, die im Bereich von 40−69 U·g⁻¹_Partikel lagen. Die M-PVA-Epoxy Partikel, welche mit der Lipase Candida rugosa A immobilisiert wurden, sind in Stabilitätsuntersuchung mit einer Magnetab-scheidung im Labormaßstab eingesetzt worden. Nach acht Zyklen/Durchgängen gingen in der Magnetabscheidung 22 % der Partikel verloren, wogegen die Enzyme nach fünf Durchgängen bei 30^◦C keinen Aktivitätsverlust aufwiesen. Magnetische Abtrennun-gen mit einem HGMS-Apparat (vgl. Kapitel 2.2.1) waren erfolgreicher, führten aber auch zu Aktivitätseinbußen. Nach 20 Durchgängen waren noch 10 % der Aktivität des Ausgangsimmobilisats vorhanden [4, 8]. Akgöl et al. verwendeten magnetische, poröse PVA-Partikel im Mikrometermaßstab. Für die Aktivierung der Hydroxylgruppen des PVA wurde 1,1’-Carbonyldiimidazol verwendet und nachfolgend das Enzym Invertase kovalent über die Aminogruppen immobilisiert. Die Restaktivität sowie die Enzymbe-ladung betrugen 74 % und 7,2 mg·g⁻¹_Partikel. Die optimalen Bedingungen für die Akti-vität des Enzyms in Hinblick auf Temperatur und pH-Wert änderten sich im Vergleich zum freien Enzym kaum, wogegen die thermische Stabilität und Lagerungsstabilität durch die Immobilisierung erhöht wurden [58]. Das Enzym Laccase wurde auf mit Polystyrene-co-Acetoacetoxyethyl Methacrylat (PS-AAEM) modifiziertem Maghemit immobilisiert. Die Partikel besaßen einen Durchmesser d_p von ca. 500 nm und wiesen 16 % Maghemit auf. Die Maghemitpartikel wurden zum einen auf die Oberfläche ange-bunden und zum anderen in den Polymerkern eingebettet (vgl. Abb. 2.18) . Dabei war die Restaktivität der Partikel mit dem Maghemitkern am größten und betrug 20 %, wogegen die Enzymbeladung bei diesen Partikeln mit 17 % am geringsten war. Da-gegen wiesen die Partikel mit den auf der Oberfläche gebundenen Maghemitpartikeln eine Restaktivität von 4 % auf. Daraus lässt sich folgern, dass anorganische Partikel auf der Trägeroberfläche zu einer Deaktivierung der immobilisierten Enzyme führen, was u.a. durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen den Enzymen und dem Ei-senoxid begründet werden kann. Die erhöhte Enzymbeladung kann durch die erhöhte Chemisorption der Enzyme erklärt werden. Die thermische Stabilität der gebundenen Laccase war im Vergleich zum freien Enzym höher [158].

2.5. ENZYMIMMOBILISIERUNGEN 35

(a) (b)

Abbildung 2.18:Schematische Darstellung von PS-AAEM mit (a) Maghemit an der Oberfläche (b) Maghemit im Kern. [158].

Bei der Enzymimmobilisierung durch Silanbeschichtungen (vgl. Kapitel 2.4.2.3) wer-den meistens Aminosilane verwendet. Dabei haben Ma et al. gezeigt, dass sich die Proteinbeladung der aminosilanbeschichteten Magnetitpartikel um das 1,4 - 2 fache im Vergleich zum unbehandelten Magnetit erhöht [28]. Mohapatra et al. erreichten eine Proteinkupplungseffizienz von 73,5 % bei Avidin und 82 % bei Glykoprotein, wo-gegen keine Bindung auf den unbeschichteten Partikeln stattfand [81]. Kobayashi und Matsunaga haben Glutaraldehyd verwendet, um die Aminogruppe des beschichteten Amionosilanmagnetitpartikels für die Enzymimmobilisierung zu aktivieren. Dadurch wurde eine Enzymbindung von 10 Gew.-% erreicht. Durch längere Silane konnte die Enzymaktivität von Protease Thermolysin von 30 % auf 50 % gesteigert werden. Die längere C-Kette der Silane fungiert als Abstandhalter [31]. Die Verwendung von Glut-araldehyd ist eine übliche Methode zur Aktivierung von Aminogruppen (vgl. Kapitel 2.5.1), weshalb sie häufig als Aktivierung bei Aminosilanen vorkommt. So wurden mit dieser Kupplungsreaktion die Enzyme EsterasePseudomonas putida und Lipase Can-dida rugosa auch kovalent immobilisiert. Bei der Immobilisierung der Esterase wurde festgestellt, dass die Partikelgröße vor und nach der Immobilisierung im gleichen Grö-ßenbereich lag und je vier Enzyme pro Partikel gebunden wurden. Die Enzymaktivi-tät betrug 63 % der AusgangsaktiviEnzymaktivi-tät, was eine spezifische AktiviEnzymaktivi-tät von0,25 U·g⁻¹ ergibt. 84 % der Aktivität blieben nach 10 Zyklen im Batchbetrieb erhalten. Die kine-tischen Parameter V_max und K_m waren gegenüber dem nativen Enzym geringer. Die pH-Wert- und Temperaturoptima blieben ähnlich im Vergleich mit denen der freien Enzyme [83]. Die immobilisierte Lipase wies eine Beladung von 7,5µg·mg⁻¹_Partikel auf und es wurde kein signifikanter Verlust der Stereoselektivität festgestellt. Die Aus-beute war im Vergleich zum freien Enzym 26 % geringer [36]. Die Autoren Jin et al.

verwenden zusätzlich zur Aminosilanisierung die Aktivierungssubstanz 1,4-Phenylen-Diisothiocyanat (PDC). Dabei wurde festgestellt, dass die magnetische Sättigung nach der Immobilisierung von 39,7 emu·g⁻¹ (bezogen auf Beschichtung) auf 22,3 emu·g⁻¹ abfällt, was laut Autoren keine Auswirkungen auf die magnetische Abtrennung hat.

Die Aktivität der immobilisierten Protease auf unbeschichteten Magnetitpartikeln war sehr gering und betrug 4 U·ml⁻¹. Durch eine Einführung von Aminogruppen über die Beschichtung konnte die Aktivität auf 2875 U·ml⁻¹ gesteigert werden. Dagegen war die Aktivität durch Direktadsorption an der Beschichtung ohne PDC geringer und betrug 165 U·ml⁻¹. Jin et al. haben eine steigende Aktivität mit erhöhter Proteinbe-ladung bis zum Erreichen der Sättigung detektiert, welche durch die begrenzte Anzahl der Bindungen erwartet wurde. Die Lagerungsstabilität der immobilisierten Enzyme war gegenüber den freien Enzymen leicht erhöht [111]. Yong et al. haben Epoxygrup-pen auf der Magnetitoberfläche durch Silanisierung und einer anschließenden weiteren Beschichtung eingeführt. Die Enzymbeladung betrug105 mg·g⁻¹ und die relative Ak-tivität nach fünf Recyclingvorgängen lag bei70 % [32].

Die Direktimmobilisierung an Magnetit wurde zuerst von Koneracka et al. mit der Kupplungssubstanz CDI (vgl. Kapitel 2.5.1) durchführt. Sie haben Protease an Magne-tit erfolgreich mit CDI angebunden, wobei eine Aktivität von 80 % des freien Enzyms erhalten bliebt und 90 % der zugegebenen Enzymmenge immobilisiert wurde. Ihren Aussagen nach erfolgt die Anbindung über die Hydroxylgruppen der Magnetitober-fläche. Die Anwesenheit des CDIs modifiziert die Carboxylgruppen des Proteins zum leicht sauren pH-Wert, was die Anbindung prozentual erhöht [42, 163]. Die Immobi-lisierung des Enzyms Alkaline Phosphatase hat ähnliche Werte gezeigt. Hierbei sind Restaktivitäten von 75 % detektiert worden und 85 % des Enzyms in Lösung wurden angebunden. Die magnetische Sättigung nach der CDI Aktivierung und der Prote-inbeladung war 22 % geringer verglichen mit den unbeschichteten Partikeln [86]. Die Forschungsgruppe band eine Vielzahl von Proteinen und Enzymen wie Rinderserum-albumin (BSA), Glukose Oxidase, Chymotrypsin, Streptokinase und Dispase auf die Magnetitpartikel und untersuchte den Einfluss von pH-Werten und unterschiedlichen Verhältnissen von Enzym, CDI und magnetischen Trägern. Das optimale Verhältnis be-trug z.B. bei der Glukose Oxidase 6:1:2 (Partikel:Enzym:CDI) bei einem pH-Wert von 4,5 und einer Temperatur von 4^◦C und es wurden 76 % des Enzyms angebunden. Das Enzym war nur unter diesen Bedingungen aktiv und wurde bei höheren Temperaturen (z.B. Raumtemperatur) und pH-Werten inaktiv [42, 54]. Weitere Untersuchungen mit der Direktimmobilisierung unter Zuhilfenahme von CDI zeigten bei Huang et al., dass es nach der Immobilisierung von Lipase zu keinen Änderungen in der Partikelgröße und -struktur kam [164]. Diese Beobachtungen wurden auch von Kouassi et al. bei der Immobilisierung von Cholesterol Oxidase gemacht [55]. Nach der Anbindung hatten die Partikel superparamagnetische Eigenschaften (vgl. Kapitel 2.3.4), wobei sich die ma-gnetische Sättigung leicht reduziert hatte, was sich mit den Aussagen von Metha et al.

deckt. Die immobilisierte Lipase hatte eine bessere pH-Wertstabilität [10]. Wang und Lee haben Trypsin und Avidin unter Verwendung der Aktivierungssubstanzen CDI und Cyanamid direkt an Magnetit gebunden. Dabei wurde festgestellt, dass die Proteinbe-ladung mit der Cyanamidaktivierung geringer war als die BeProteinbe-ladung bei CDI aktivierten Partikeln. Die maximal erreichte Proteinträgerbeladung mit einer CDI basierten Bin-dung betrug35 mg·mg⁻¹. Sie vermuten, dass CDI die elektrophilen Gruppen des Ma-gnetits, vermutlich die Hydroxylgruppen, aktiviert, damit diese Gruppen eine Bindung mit den Aminogruppen des Proteins eingehen. Koneracka et al. nehmen einen anderen Bindungsmechanismus an. Weiterhin bemerkten sie, dass ein zu hohes Verhältnis von CDI zu Magnetit die Koagulation aufgrund wahrscheinlicher Vernetzung fördert, was Auswirkungen auf die Suspensionsstabilität hat. Bei einem Verhältnis unterhalb von 0,5 CDI/Magnetit gehen sie von einer langzeitstabilen Suspension aus [164]. Saiyed et al. untersuchten den Einfluss des Direktimmobilisierungsverfahren mit CDI auf Alkali-ne Phosphatase, wenn die Anbindung durch Schüttel- oder Ultraschallmethode erfolgte.

Die Bindungseffizienz war bei beiden Methoden ähnlich in einem Bereich von 80-100 %, wobei die verbleibende Aktivität bei den Schüttelversuchen bei 20-38 % und der Ul-traschallmethode bei 30-43 % lag. Demnach ist die Aktivität der UlUl-traschallmethode im Vergleich zu den Schüttelversuchen höher, wobei immer noch ein Aktivitätsverlust zwischen 57-70 % zu verzeichnen ist. Die Lagerungsstabilität wurde im Vergleich zum nativen Enzym verbessert [165].