9.1 Bezugsquellen
9.1.6 Verbrauchsmaterialien Kunststoffeinbettung
Material Verwendung Bezugsquelle
4% neutral gepufferte Formalinlösung
Fixierung
Aceton Intermedium Merck KGaA; Darmstadt,
Deutschland Technovit® 9100
Kunststoffein-bettung
Heraeus Kulzer GmbH;
Wehrheim, Deutschland Einbettformen, 40 mm
Kunststoffein-bettung
Heraeus Kulzer GmbH;
Wehrheim, Deutschland 9.1.7 Geräte und Software
Material Verwendung Bezugsquelle
Sterilbank (Hera Safe, Typ HS18) Zellkultur Heraeus Instruments;
Hanau, Deutschland Zentrifuge (Megafuge, 1 0R) Zellkultur Heraeus Instruments;
Hanau, Deutschland Brutschrank (Hera Cell) Zellkultur Heraeus Instruments;
Hanau, Deutschland Brutschrank Roller (Shake 'n'
Stock)
Zellkultur Hybaid Ltd.; Middlese,UK
Brutschrank Immunhistologie Heraeus Instruments;
Hanau, Deutschland Roller (CAT RM 5.40) Transfektion Fröbel Labortechnik
GmbH; Lindau, Deutschland Mikroskop (Axiovert 25) Beurteilung der
Knochenmarks-zellen
Carl Zeiss
Lichtmikroskopie;
Göttingen, Deutschland MRX Microplate Reader ELISA Auswertung Dynatech Medical
Products; Guernsey, Channel Islands, Great Britain
Wasserbad Zellkultur GFL®; Burgwedel,
Deutschland Neubauer-Zählkammer (Tiefe 0,1
mm, 0,0025 mm²)
Zellzählung Omnilab Laborzentrum;
Bremen, Deutschland Autoklav (Tuttnauer 5050 EL) Autoklavieren Systec GmbH
Laborsystemtechnik;
Wettenberg, Deutschland Sterilisator (Hereaus Function
Line)
Sterilisation Heraeus Instruments;
Hanau, Deutschland Aqua purificator (G7795) Destillation Miele & Cie. KG;
Gütersloh, Deutschland
Chemikalienwaage (BP 1200 und BP 211S)
Chemikalienwaage Sartorius AG; Göttingen, Deutschland
Abzug (LAFA™) Histologie Casper & Co. Labora;
Aachen, Deutschland Hanaulux® 2003 Lichtquelle OP Heraeus Instruments;
Hanau, Deutschland Kühlschrank (Liebherr Premium) Zellkultur Liebherr AG;
Ochsenhausen, Deutschland Kühlschrank (Liebherr Glass Line) Immunhistologie Liebherr AG;
Ochsernhausen, Deutschland Gefrierschrank (-20°C) (Liebherr
Premium)
Zellkultur Liebherr AG;
Ochsenhausen, Deutschland
MR 3001 K Magnetrührer Heidolph Instruments GmbH & Co. KG;
Schwabach, Deutschland
MP 225 pH-Meter Mettler-Toledo;
Schwerzenbach, Schweiz
Carl Zeiss Vision GmbH;
München; Deutschland Axio Vision Rel. 4.4 (06-2005) Programm für die
Gefäßdichte-Bestimmung
Carl Zeiss Vision GmbH;
München, Deutschland
VGStudio Max 1.2.1 Programm zur Knochenflächen-bestimmung
Volume Graphics;
Heidelberg; Deutschland
SPSS 10.01 Statistikprogramm SPSS Inc.; Chicago, Illinois, USA
µCT 80, Scanco Medical Mikro CT Scanco Medical AG;
Bassersdorf, Schweiz
ScanJet 3c/T Durchlichtscanner
für Röntgenbilder Grunewald GmbH & Co.
KG; Laudenbach, Grunewald GmbH & Co.
KG; Laudenbach, Deutschland
EXAKT-Präzisionsklebepresse Kleberaushärtung PSI Medizintechnik
mit Blaulicht Grunewald GmbH & Co.
KG; Laudenbach, Deutschland Unimax 1010 (137/min) Rüttelplatte für
Immunhistologie
Heidolph Instruments GmbH & Co. KG;
Schwabach, Deutschland Röntgengerät, Multix Top Röntgenaufnahmen Siemens AG; München;
Deutschland AGFA HT 1000 G Plus,
18 x 24 cm
Röntgenfilm Agfa Deutschland Vertriebs GmbH & Cie.
KG
CDS 400, Tageslichtsystem Röntgenentwickler DuPont AG; Bad
Homburg; Deutschland Kodak Dryview 8900 Ausgabegerät für
Röntgenbilder
Kodak GmbH, Stuttgart;
Deutschland
9.2 Reagenzien/Rezepte
9.2.1 Expansionsmedium nach Verfaillie
Reagenzien Menge für 1 Liter Medium
DMEM high Glucose 547,5 ml
MCDB 201 400 ml
FKS 20 ml
ITS Supplement 20 ml
Penicillin/Streptomycin 10 ml
Dexamethason 2 ml
Ascorbinsäure-2-Phosphat-1,5Mg 580 µl
Medium steril filtrieren, Lagerung bei – 20°C für m ax. 8 Wochen. Erst nach dem Auftauen Zugabe der Wachstumsfaktoren.
Wachstumsfaktoren für 50 ml Medium
rh EGF 50µl
rh PDGF-BB 50µl
9.2.2 Verdauungsmedium
Reagenzien Mengen für 40 ml Medium
Kollagenase B (Konzentration 1,5 mg/ml) 4 ml Hyaluronidase (Konzentration 0,1 mg/ml) 4 ml Expansionsmedium nach Verfaillie 32 ml
9.2.3 Formalinlösung zur Gewebefixation
Reagenzien Mengen
NaH2PO4 mit H20 10 g
NaH2PO4 16,2 g
Formalin 37%ig 250 ml
Aqua dest. 2062,5 ml
pH 7,4, Lagerung in dunkler Glasflasche
9.2.4 BSA
Reagenzien Menge für 5 ml Lösung
Albumin 50 mg für 1%ig/250 mg für 5%ig
PBS 5 ml
9.2.5 TBST-Puffer
Reagenzien Menge für 2 Liter Lösung
Tris-HCl 1 molar, pH 7,6 100 ml
NaCl 35 g
Aqua dest. 2 l
Tween 20 2 ml
9.2.6 PBS (Phosphatpuffer)
nach DAKO Handbuch, 0,1 M auf 1 Liter Aqua dest. (pH 7,2)
Reagenzien Menge für 1 Liter
Na2HPO4 1,48 g
KH2PO4 0,43 g
NaCl 7,20 g
9.3 Protokoll
9.3.1 Plasmid-Präparation 1) Bakterienstamm:
Die DNA wurde aus dem Escherichia coli-Stamm (E. coli) JM109 gewonnen. Die Lagerung erfolgte als Glycerolstock bei – 80°
2) Anzuchtmedium: Luria Bertani Medium (LBM)
Reagenzien Menge für 1 Liter Lösung
Tryptone 10 g
yeast extract 5 g
NaCl 10 g
steriles Wasser 500 ml
3) Anzucht:
Reagenzien Menge für 1 Liter Lösung
LBM (autoklaviert) 5 mg
E. coli JM109 (VEGF oder leer) 1 Pipettenspitze
Ampillicin 5 µl
(1 µl Ampillicin/1ml LBM einer 10mg/ml Ampicillinlösung)
Lösung für 6 Stunden auf Rüttler, damit sich die wachsende Kultur besser verteilen kann.
Danach werden die Bakterienkulturen gleichmäßig auf drei sterile 1000 ml fassende Flaschen verteilt und mit LBM auf insgesamt 2,5 Liter aufgefüllt.
Erneute Zugabe von 2,5 ml Ampicillin (auf 2,5 l Medium verteilt), Kultur über Nacht bei 36°C auf dem Rüttler weiterzüchten. Die Anzucht behälter leicht geöffnet lassen, um eine Sauerstoffversorgung zu ermöglichen.
Zur Bakterienernte die Bakterienlösung am nächsten Tag in Zentrifugierflaschen umfüllen und 4 Minuten bei 6000 rpm zentrifugieren. Nach 15 Minuten lagern sich die Bakterien am unteren Rand des Gefäßes ab und der Überstand kann verworfen werden.
4) Bakterienlyse:
Plasmid Giga Kit ; Fa. Qiagen
- Puffer 1 mit RNAse A mischen und dann gleichmäßig auf Zentrifugierbehälter verteilen
- umfüllen in sterile 500 ml Flasche
- Puffer 2 hinzugeben und durch mehrmaliges langsames! Pipettieren mit Lösung vermischen
- Inkubationszeit max. 5 Minuten -> Lösung erscheint viskös
- Puffer 3 hinzugeben und sofort durch Pipettieren vermischen -> flockig, weiße Suspension
- Lysat durch QIAfilter in neue sterile 500 ml Flasche gießen, 10 Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren (Filter nicht bewegen!)
- Vakuumfiltration
5) Plasmid-DNA-Gewinnung:
Plasmid Giga Kit ; Fa. Qiagen a) DNA-Reinigung:
- FWB-Puffer in oben verwendeten Filter geben und mit Spatel vorsichtig umrühren -> Plasmid-Ausbeute kann so gesteigert werden
- Sterilfiltration
- klarem Lysat wird ER-Puffer zugesetzt - Inkubation für 30 Inuten auf Eis
b) Säulenequilibrierung
-Durchführung kurz vor Gebrauch
- QBT-Puffer in Säule geben -> Säule wird bindungsfähig für DNA c) Gewinnung gereinigter DNA
- Lysat in Säule geben (Dauer ca. 1 Stunde)
- Filter mit QC-Puffer waschen (Dauer ca. 1,5 Stunden)
- QN-Puffer in die Säule geben -> gereinigte DNA tropft in sterile 250 ml Flasche - DNA mit 70 %igen Isopropanol lösen
- 30 Minuten bei 4°C und 11000 rpm zentrifugieren - > DNA als weißer Niederschlag sichtbar
- Entfernung der gefällten Salze mit endotoxinfreiem 70 %igen Ethanol -10 Minuten bei 4°C und 11000 rpm zentrifugieren
- Überstand vorsichtig abpipettieren
- zum trocknen Pellet 20 Minuten unter den Abzug stellen d) Konzentrationsbestimmung im Photometer
-DNA 1:100 mit TE-Puffer verdünnt und Konzentration bestimmt
9.3.2 Kunststoffeinbettung mit Technovit® 9100
Vorgang Reagenzien Dauer
Präinfiltration 1 stabilisierte Basislösung + Härter 1
im Vakuum 10 min. bis 24 Std.
Präinfiltration 2 entstabilisierte
Basislösung + Härter 1
im Vakuum 10 min. bis 24
Basislösung + Härter 2 +Polymerisationsregler
Behälter bis zum Rand voll gießen; im Vakuum 10 min. bei -8°C, danach Deckel fest verschließen und bei – 8°C
polymerisieren
Polymerisation 3-15 ml 18 bis 24 Std. bei
-4 °C
60 ml 2 bis 3 Tage bei -8°C
Die Herstellung der einzelnen Reagenzien erfolgte nach der Gebrauchsanweisung!
9.3.3 Toluidin-Giemsa-Färbung
Lösungen: Giemsa-Stammlösung, 1%-ige Toluidin-Lösung, 10%-ige H2O2-Lösung, Aqua dest., 70%-iges Ethanol
Vorgang Dauer
1. Präparate in 10%iger H2O2-Lösung bewegen 5 min.
2. Präparate in Aqua dest. spülen und trocknen spülen 3. Präparate mit Giemsa-Stammlösung überschichten 20 min.
4. Präparate in Aqua dest. einstellen und anschließend trocknen 2 mal spülen 5. Präparate mit 1%iger Toluidin-Lösung überschichten 20 min.
6. Präparate in Aqua dest. spülen 2 mal spülen
7. Präparate kurz in 70%iges Ethanol einstellen 15 sek.
8. Präparate trocknen
Ergebnis: Mineralisierte Knochengrundsubstanz und Zahnschmelz schwach blau.
Knorpelgrundsubstanz metachromatisch violett. Osteoid und Dentin hellblau. Kerne blau.
9.3.4 Immunhistologie Tag 1:
Reagenzien Dauer
MEA I 6 Stunden
MEA II über Nacht unter dem Abzug stehen lassen
Tag 2:
Reagenzien Dauer
XEM I, II, III 3 x 30 min
Isopropanol 100%, 96%, 70%, 50%, 20% je 10 min
2 maliges Spülen der Präparate in Aqua dest., vorsichtiges Trocknen und Verbringen in eine feuchte Kammer, Probe mit Liquid-Stopper umranden,
Alle Reaktionsschritte finden in der feuchten Kammer statt!
Vorgang Menge Dauer
Chymotrypsin 500 µl 1 Std. im Brutschrank bei 37°C Aqua dest. - 2 mal spülen, dann trocknen Peroxydase-Blocker 300µl 30 min., Zimmertemperatur Aqua dest. - 2 mal spülen, dann trocknen 5%iges BSA 300 µl 30 min., Zimmertemperatur
- - BSA abgießen
Antikörper mit 1%igen BSA im Verhältnis 1:10
300 µl über Nacht im Kühlschrank
3.Tag:
Vorgang Menge Dauer
TBST-Puffer - 3 x 5 min. auf Rüttelplatte Anti-Mouse Immunglobulin
HRP
300 µl 30 min, Zimmertemperatur
TBST-Puffer - 3 x 5 min. auf Rüttelplatte
Amplification Reagent 300 µl 30 min., im dunkeln bei Zimmertemperatur TBST-Puffer - 3 x 5 min. auf Rüttelplatte
Anti-Floureszin-HRP 300 µl 30 min, Zimmertemperatur TBST-Puffer - 3 x 5 min. auf Rüttelplatte DAB-Chromagen 20µl/ml 250 µl 15 min., Zimmertemperatur 100%iges Isopropanol - 1 min.
XEM - 4 min., dann mit Deckglas eindecken, über
Nacht aushärten lassen
9.4 Danksagung
Ich möchte PD Dr. med. F. Geiger für die die Bereitstellung des Themas und die wissenschaftliche Betreuung und Unterstützung bei der Durchführung dieser Dissertation danken.
Prof. Dr. med. vet. M. Fehr danke ich für die Übernahme der Betreuung seitens der Tierärztlichen Hochschule Hannover.
Prof. Dr. W. Richter danke ich für die Bereitstellung der Forschungseinrichtung an der Stiftung orthopädische Universitätsklinik Heidelberg.
Weiterhin bedanke ich mich bei Dr. Ing. D. Bormann vom Institut für Werkstoffkunde der Universität Hannover, für die Durchführung und Auswertung der Mikro-CT-Daten.
Bei Frau R. Föhr und K. Götzke möchte ich mich herzlich für die Hilfe bei der
histologischen Aufarbeitung der Proben bedanken, sowie für das nette Miteinander.
Einen ganz speziellen Dank gilt Dr. med. vet. H. Lorenz , ohne die mir der Einstieg in die Thematik, Methodik und das Handling der Tiere, sowie die Terminplanung sehr schwer gefallen wäre.
Vielen Dank auch an alle, die für mich Korrektur gelesen und mir beim übersetzen geholfen haben. Vielen Dank Judith, Dominik und Menne.
Zu guter letzt möchte ich mich von Herzen bei meiner Familie, besonders meinen Eltern und Olli bedanken. Dafür, dass sie mir immer den Rücken stärken und mir die Freiheit lassen, meinen eigenen Weg zu gehen.