Fixierung

Nach der Entnahme der Proben aus der Formalinlösung erfolgte die Entwässerung in einer ansteigenden Alkoholreihe. Hierzu wurden die Proben zunächst für mindestens 24 Stunden (Lagerung für mehrere Tage möglich) in 70%igen 2-Propanol (Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) im Vakuum bei Raumtemperatur gelagert. Dasselbe wurde danach in Folge mit 80%igem 2-Propanol, zweimal mit 96%igem 2-Propanol und dreimal mit 100%igem 2-Propanol durchgeführt.

Die Proben wurden dann für 10 Minuten bis 24 Stunden in Aceton bei 20 °C im Vakuum verbracht. Das Aceton diente als Intermedium zwischen der Fixierung und der Einbettung. Es entfernt Fett vom Gewebe und erleichtert so das Eindringen der Polymerisations-Lösung.

3.6.3 Kunststoffeinbettung

Die Einbettung des vorbereiteten Probenblockes erfolgte mit Technovit® 9100 (Fa.

Hereaus Kulzer GmbH, Wehrheim, Deutschland). Die einzelnen Arbeitsschritte bestehend aus der Präinfiltration 1 und 2, der Infiltration, sowie dem Ansetzen der Polymerisationslösung sind dem Protokoll im Anhang zu entnehmen.

Die Einbettung erfolgte in speziellen, verschließbaren Einbettformen (40 mm; Fa.

Hereaus Kulzer GmbH, Wehrheim, Deutschland). Die Proben wurden mit einer Pinzette so in die Formen verbracht, dass sich Radius und Ulna parallel zu deren Unterseite befanden. Bei der anschließenden Zugabe der Polymerisationslösung wurde darauf geachtet, dass sich die Lage des Probenblockes nicht veränderte, um später eine standardisierte Auswahl der Region zu ermöglichen.

Der befüllte Behälter wurde dann mit einem Deckel fest verschlossen und für zwei bis drei Tage bei – 8°C aufbewahrt. Danach wurden d ie eingebetteten Proben entnommen und bei Raumtemperatur für zwei weitere Tage endgültig ausgehärtet.

3.6.4 Schleifen

Nach vollständiger Aushärtung des Kunststoffes wurden die Präparate durch Sägen und Schleifen weiterbearbeitet.

Die Säge (EXAKT-Trennschleifsystem Makro; Fa. PSI Medizintechnik, Grunewald GmbH & Co. K, Laudenbach, Deutschland) war bei allen Vorgängen auf Geschwin-digkeitsstufe sieben eingestellt, eine gleichmäßige Sägebelastung wurde durch ein Gewicht am beweglichen Probenwagen erreicht.

Bei den beschriebenen Schleifvorgängen (Mikro-Schleifsystem EXAKT 400 CS; Fa.

PSI Medizintechnik, Grunewald GmbH & Co. KG, Laudenbach, Deutschland) wurde der Objektträger durch ein Vakuum an einen fahrbaren Aufbau gesaugt, der dann auf

das rotierende, mit Wasser befeuchtete Schleifpapier (Fa. PSI Medizintechnik, Grunewald GmbH & Co. KG, Laudenbach, Deutschland) herabgesenkt wurde. Um eine gleichmäßige Belastung zu erreichen, wurde an den abgesenkten Aufbau ein Gewicht gehängt. Der Aufbau bewegte sich gleichmäßig von links nach rechts über das Schleifpapier.

Als erstes wurden der überschüssige Kunststoff an den Seiten und die unebene Oberseite des Probenblockes durch die Säge entfernt.

Anschließend wurde auf die Ober- und Unterseite je ein Plastikobjektträger (Plexiglas® XT-Farblos 2050 mm x 2 mm; Fa. Cadillac Plastic GmbH; Viernheim;

Deutschland) durch einen Präzisionskleber (Technovit® 7200 VCL; Fa. PSI Medizin-technik, Grunewald GmbH & Co. KG, Laudenbach, Deutschland) aufgebracht. Unter einer Blaulichtlampe (EXAKT-Präzisionsklebepresse mit Blaulicht; Fa. PSI Medizin-technik, Grunewald GmbH & Co. KG, Laudenbach, Deutschland) konnte der Kleber für 5 Minuten aushärten. Die Proben wurden anschließend weitere 60 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Die Gebilde wurden anschließend mit der Säge so getrennt, dass das jeweilige Implantat sowie der angrenzende Radius und die Ulna der Länge nach in der Mitte halbiert wurden. Die beiden so entstandenen Probenteile wurden dann mit der Schleifmaschine bearbeitet, so dass eine ebene, polierte

Fläche entstand. Dazu wurden verschiedene Schleif- und Polierblätter mit feiner werdender Oberfläche (P800→P1200 →P2500→ K4000) eingesetzt. Nach Trocknung der Proben wurde die eine Hälfte, wie oben beschrieben, auf einen Plastikobjektträger mittels Technovit® 7200 VCL (Fa. PSI Medizintechnik) geklebt.

Die andere Probenhälfte wurde in der gleichen Art und Weise auf einen

Glas-objektträger (Glasträger 10 cm x 5 cm; h= 2 mm; Fa. Glas-Reidel GmbH, Heidelberg, Deutschland) aufgebracht.

Der Glasobjektträger diente zur späteren Durchführung der Immunhistologie. Vor dem Aufkleben des Präparates wurde das Glas silanisiert. Dazu wurde eine transparente Silan-Haftvermittlerlösung (Silicoup®; Fa. Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland) mit einem Pinsel auf die sauberen Glasträger aufgebracht und trocknen gelassen.

Nach dem Aushärten des Klebers wurden die Proben erneut mit der Säge halbiert, so dass auf dem neu aufgeklebten Objektträger 200 bis 300 µm des Präparates vorhanden waren. Um die genaue Dicke der Probe ermitteln zu können, wurden sowohl die polierte Probe mit Objektträger, als auch der zweite Objektträger alleine und schließlich beide zusammen an jeweils sechs Stellen gemessen, der Mittelwert gebildet und der Kleberanteil errechnet. Nach Messung des zweiten Objektträgers mit der aufgeklebten Probe konnte durch Subtrahieren der Probenanteil ermittelt werden.

Die Präparate wurden erneut geschliffen, bis sie eine Dicke von 15-30 µm hatten.

Dazu wurden wie oben beschrieben verschiedene Schleifblätter eingesetzt. Die jeweiligen Schleifetappen sind der Tabelle 2 zu entnehmen, sie wurden während des Schleifens durch Dickenmessung bestimmt.

Tabelle 2: verwendete Schleifpapiere und entsprechende Probendicke Schleif- und Polierpapier Probendicke in µm auf

Plastikobjektträger

Probendicke in µm auf Glasobjektträger

P 800 70 80

P1200 50 60

P 2500 30 40

K 4000 20 30

3.6.5 Toluidin/Giemsa-Färbung (TG)

Bestimmte Färbelösungen können auch in kunstharzeingebettete Dünnschliff-präparate eindringen und so eine Oberflächenfärbung ergeben, die bis zu einer gewissen Schichtdicke Zellen und Gewebestrukturen in Farbkontrasten hervorhebt.

Die Präparatschliffe auf den Plastikobjektträgern wurden mittels Giemsa Stamm-lösung (Azur-Eosin-Methylenblau; Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) und 1%iger Toluidinblau-Lösung (Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland) gefärbt.

Die Giemsa-Färbung ergibt einen guten Farbkontrast zwischen den Zellen der Interzellulärsubstanz der Weich- und Hartgewebe. Die Toluidinblau-Färbung liefert zusätzlich neben einer klaren orthochromatischen (blau) Zell- und Weichteilfärbung auch eine metachomatische (violett) Färbereaktion saurer Glykosaminoglykane. Bei der Toluidin/Giemsa-Färbung stellt sich die mineralisierte Knochengrundsubstanz ungefärbt bis blassblau dar, wohingegen sich das Osteoid hellblau und die Zellkerne blau färben. Die Knorpelgrundsubstanz zeigt sich metachromatisch violett.

Vor Beginn der Färbung wurden die Giemsa-Stammlösung und die Toluidinblau-Lösung gefiltert. Die Präparate wurden zunächst 5 Minuten in 10%igem H2O2 (Fa.

Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) zum Anätzen geschwenkt, so dass die Farb-stoffe besser eindringen konnten. Anschließend wurden die Proben in destilliertem Wasser (Aqua dest.) abgespült und abgetrocknet und für 20 Minuten mit Giemsa-Stammlösung überschichtet. Danach wurden die Präparate zweimal in Aqua dest.

gewässert, erneut getrocknet und für 20 Minuten in 1%ige Toluidinblau-Lösung gestellt. Zum Abschluss wurden sie mit destilliertem Wasser gespült und für ca. 15 Sek. in 70%iges Ethanol (Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) gestellt. Das Färbeprotokoll ist dem Anhang beigefügt.

3.6.6 Immunhistochemische Färbung (IHC)

Das Ziel der IHC-Färbung war es, die Endothelzellen der neu gebildeten Blutgefäße im Bereich des Implantates anzufärben. Dazu wurden die auf den silanisierten Glasobjektträgern fixierten Schliffe verwendet.

Am ersten Tag wurden die Präparate zum Entplasten (=entfetten/entwachsen) in Methoxyethylacetat (MEA) (Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) eingestellt, nach 6 Stunden in frisches MEA überführt und über Nacht unter dem Abzug stehen gelassen.

Am zweiten Tag wurden die Schliffe dreimal für je 30 Minuten in Xylolersatz (XEM-200; Fa. Vogel GmbH & Co. KG, Giessen, Deutschland) unter dem Abzug entfettet.

Danach wurden die Proben in einer absteigenden Alkoholreihe dehydriert. Dazu wurden diese jeweils 10 Minuten in 100%-, 96%-, 70%-, 50%- und 20%iges 2-Propanol (Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) verbracht. Nach zweimaligem

Wässern mit Aqua dest. wurden die Objektträger vorsichtig mit Papier getrocknet.

Jede Probe wurde mit einen Liquid Blocker (Fa. Daido Sangyo, Tokio, Japan) umrandet, um ein Abfließen der Reagenzien zu verhindern und in eine feuchte Kammer verbracht. Bei der feuchten Kammer handelte es sich um eine verschließ-bare Plastikdose, in der ein feuchtes Tuch lag, welches die Präparate während der Inkubationszeiten vor dem Austrocknen schützt, da es sonst zu unspezifischen Hintergrundfärbungen hätte kommen können.

Anschließend wurden die Schliffe mit je 500 µl Chymotrypsin (A-Chymotrypsin Typ II from Bovine Pancreas; Fa. Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland) für 30 Minuten im Brutschrank (Fa. Hereaus Instruments, Hanau, Deutschland) bei 37°C inkubiert. Das Chymotrypsin wurde vor der Vera rbeitung im Wasserbad auf 37°C erwärmt, um eine optimale Reaktion zu erreiche n.

Im Anschluß an diese Reaktion begann die eigentliche Immunhistologie. Dazu wurde ein standardisiertes Kitt (CSA II, Biotin-free; Tyramide Sigmal Amplication System;

Fa. Dako Deutschland, Hamburg, Deutschland) verwendet. Es war zu beachten, dass die gesamte Probe mit den entsprechenden Reagenzien bedeckt war und es zu keiner Austrocknung der Probe zwischen den einzelnen Arbeitsschritten kam.

Das Chymotrypsin wurde durch zweimaliges Spülen in Aqua dest. entfernt und die Proben für 30 Minuten mit Peroxydase-Block (Fa. Dako Deutschland) bei Raum-temperatur in der feuchten Kammer inkubiert. Der Peroxydase-Block diente der Unterdrückung der endogenen Peroxydase-Aktivität der Proben, wodurch es sonst zu unspezifischen Hintergrundfärbungen hätte kommen können.

Im Anschluß daran erfolgten die Blockung unspezifischer Antigenbindungen und die Absättigung endogener Proteine. Hierzu wurden die Peroxydreste durch zwei-maliges Spülen in Aqua dest. entfernt und die Präparate erneut für 30 Minuten bei Zimmertemperatur mit je 300 µl 5%igen Bovinen Serum Albumin (BSA) benetzt.

Während der Inkubationszeit wurden die Primärantikörper (Monoclonal Mouse Anti-Human CD31, Endothelial Cell Clone, JC70A; Fa. Dako Deutschland) mit 1% BSA in einem Verhältnis von 1:10 vermischt und dann auf die zweimal gewässerten Proben je 300 µl dieses Gemisches aufgebracht und über Nacht im Kühlschrank (Liebherr Glass Line; Fa. Liebherr AG, Ochsernhausen, Deutschland) bei 4 °C inkubiert.

Am dritten Tag wurden die überschüssigen Antikörper mittels eines Waschpuffers entfernt. Hierzu wurden die Proben dreimal für 5 Minuten in Tris-buffered-saline-Tweed-Puffer (TBST) eingestellt und auf einer Rüttelplatte (Unimax 1010 (137/min);

Fa. Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach, Deutschland) gewaschen.

Danach erfolgte die Bindung von peroxydasekonjugierten sekundären Antikörpern an die Primärantikörpern. Dazu wurde jede Probe für 30 Minuten bei Zimmertemperatur in der feuchten Kammer mit 300 µl Anti-Mouse-Immunglobulin-HRP (Fa. Dako Deutschland) inkubiert.

Nach der Wiederholung des oben genannten Waschvorgangs wurden die Proben mit Amplification Reagent (Fa. Dako Deutschland) benetzt und bei Zimmertemperatur in Dunkelheit für 30 Minuten belassen. Hierbei diente die vorher gebundene Peroxy-dase als Katalysator für die Oxidation des floureszinkonjugierten Phenols

(Amplification Reagent), welches dann auf der Probe ausfiel. Im nächsten Schritt folgte der Nachweis des gebundenen Floureszins durch ein peroxydasekonjugiertes Anti-Floureszin. Hierzu wurde nach dem Spülvorgang 300 µl Anti-Floureszin-HRP (Fa. Dako Deutschland) je Probe für 30 Minuten bei Zimmertemperatur aufgebracht.

Im Anschluß an erneutes Spülen wurden je Objektträger 250 µl DAB-Substrat-Puffer (Dako Deutschland) gemischt mit DAB-Chromagen (Fa. Dako Deutschland) im

Verhältnis von 1:500 aufgebracht und für 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert.

Hierdurch wurde die Färbung abgeschlossen und als eine Braunfärbung am Ort des Antigens sichtbar.

Zum Abschluss wurden die Schliffe eingedeckt. Dazu wurden die Proben für 1 Minute in 100%iges Isopropanol (Fa. Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) und anschließend für 4 Minuten in XEM-200 (Fa. Vogel GmbH & Co. KG, Giessen, Deutschland) gestellt. Das Eindecken erfolgte mittels eines

Mikroskopier-Einschlussmittels (Hico Mic®; Fa. Hirtz & Co., Köln, Deutschland) unter Verwendung von Deckgläsern (Menzel GmbH, Braunschweig, Deutschland).

Alle Färbungen wurden auf die gleiche Weise durchgeführt. Ein kurzes Färbeproto-koll sowie die Rezeptvorlagen für die Herstellung des BSA und des TBST-Puffers sind im Anhang einzusehen.

3.6.6.1 CD31-Antikörper

Bei dem verwendeten Antikörper handelt es sich um einen monoklonalen Maus-antikörper (Monoclonale Mouse Anti-Human CD31, Endothelial Cell, Clone JC70A, Code No. M 0823; Fa. Dako Deutschland, Hamburg, Deutschland). Dieses Protein markiert primär Endothelzellen. Hierfür geht es eine Bindung mit dem Antigen CD31 ein, welches auf allen Endothelzellen exprimiert wird.

CD31 ist ein einkettiges Transmembranprotein, das zur Superfamilie der Immun-globuline gehört. Es spielt sowohl eine Rolle bei abhäsiven Interaktionen von benachbarten Endothelzellen, als auch zwischen Leukozyten und Endothelzellen.

Eine immunhistologische Färbung des CD31-Antigens ist daher geeignet, die Blutgefäße selbst kleinster Kapillaren darzustellen.

Ein Synonym für CD31 ist PECAM-1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule).