Ziel dieser Arbeit war es, die Wirkung des Wachstumsfaktors VEGF auf die
Vaskularisation und Osteogenese in den festen Knochenersatzstoffen β-TCP und CDHA zu untersuchen.
Die durchgeführten Untersuchungen zeigten, dass es durch den Einsatz von VEGF in einem Knochendefekt möglich ist, die Angiogenese zu steigern und den Umbau von Knochenersatzstoffen zu fördern. Abhängig vom verwendeten Trägermaterial kann die Knochenneubildung gesteigert oder auch gehemmt werden. Es zeigte sich, dass bei der Applikation von β-TCP in Kombination mit VEGF transfizierten BMSC eine stärkere Osteogenese nachgewiesen werden konnte, als bei der Verwendung von CDHA als Trägermaterial. Die eigenen Resultate weisen darauf hin, dass die Knochenheilung nicht durch Hinzufügen eines der drei Grundbausteine der Osteogenese alleine, sei es ein bestimmter Knochenersatzstoff, die Stammzell-besiedelung oder ein Wachstumsfaktor, stimuliert werden kann. Erst durch das Zusammenwirken aller Faktoren (=Tissue Engineering) kann das Ziel einer vollständigen Defektheilung erreicht und so die Entstehung von Pseudarthrosen verhindert werden.
In Zukunft sollte geprüft werden, welche Wechselwirkungen der Implantationsort (vital/avital), das Trägermaterial und die Kombination mit verschiedenen Wachstums-faktoren aufweisen, mit dem Ziel ein vaskularisiertes Knochenimplantat zu
entwickeln, welches das Überleben und die Integration von gebildeten und dem vorhandenen/umgebenen Gewebe ermöglicht. Je nach Durchblutungssituation und Größe des Defektes werden verschiedene Kombinationen von Wachstums-faktoren nötig sein.
Die Zukunft könnte in der gemeinsamen Verwendung von VEGF und BMP liegen.
Wie die eigenen Ergebnisse zeigen, fördert VEGF die Angiogenese und den Abbau der Keramik. Betrachtet man die Wachstumsfaktoren BMP, so zeigte z. B. BMP-2 eine Knochenbildung bei Defekten kritischer Größe in verschiedenen Tierstudien (VERTENTEN et al., 2010). In Kombination beider könnten BMP die Knochenbildung steigern und VEGF für eine ausreichende Vaskularisation sorgen, so dass auch größere Defekte überbrückt werden können. KANCZLER et al. (2010) untersuchten
die Heilungsfähigkeit eines Defektes kritischer Größe durch den Einsatz eines VEGF165/BMP-2 sezernierenden Alginat-Trägers, welcher zusätzlich mit humanen BMSC beschichtet wurde. Es konnte gezeigt werden, dass signifikant mehr Knochen gebildet wurde, als in den Kontrollgruppen. Allerdings konnten PENG et al. (2005) nachweisen, dass die Relation der beiden Wachstumsfaktoren zueinander
entscheidend für die Knochenneubildung ist.
Wie oben genannte Studien zeigen, kann durch die Kombination von BMSC mit angiogenen und osteogenen Wachstumsfaktoren auf einem biodegradierbaren Träger, die Regeneration und Reparation von Defekten kritischer Größe gefördert werden.
In der Veterinärmedizin wird zur Heilung von Knochendefekten kritischer Größe und damit zur Vermeidung der Ausbildung einer Pseudarthrose das Tissue Engineering aus Kostengründen noch sehr selten angewendet. Die Ruhigstellung der Fraktur ist bei kritischen Defekten ein Hauptziel, um die Pseudarthrosebildung zu verhindern.
Gerade beim Tier ist es jedoch wichtig, nach erfolgter Fraktur die Mobilität schnell wieder herzustellen, da die Möglichkeit zur Ruhigstellung der Gliedmaße nur sehr begrenzt gegeben ist. Die Methoden des Tissue Engineering könnten die Heilungs-zeit verkürzen und die Herstellung der Mobilität beschleunigen. Schon jetzt lassen verschiedene Studien erkennen, dass eine erfolgreiche Anwendung dieser
Techniken auch am Tier möglich ist (HAUSCHILD et al. 2005; BREHM, 2007). Auch die vielfältigen experimentellen Tierstudien machen dies deutlich.
6 Zusammenfassung
Mirjam Beverungen
Überprüfung der Wirkung des gefäßinduzierenden Wachstumsfaktors VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) auf die Vaskularisierung und
Osteogenese in festen Knochenersatzstoffen
Die Rekonstruktion größerer Knochendefekte nach Frakturen oder Knochenresek-tionen und die damit einhergehende Gefahr der Entstehung von Pseudarthrosen ist ein aktuelles Problem in der Orthopädie und Unfallchirurgie bei Mensch und Tier.
In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb der Einfluss von VEGF, einem gefäß-induzierenden Wachstumsfaktor, auf die Angiogenese und Osteogenese auf zwei verschiedenen Trägermaterialien (β-TCP und CDHA) untersucht werden.
Dazu erfolgten Untersuchungen an 36 New Zealand White Kaninchen in einem etablierten Radius-Defekt-Model. BMSCs wurden den Tieren zuvor entnommen und in vitro expandiert. Die 36 Tiere wurden in sechs Gruppen eingeteilt (β-TCP/CDHA ohne Zellen, mit BMSC, mit VEGF transfizierten BMSC). In regelmäßigen Abständen erfolgte eine Röntgenkontrolle. Dabei wurde anhand eines Scores die knöcherne Durchbauung sowie die Resorption des Trägerstoffes beurteilt. Die Tiere wurden nach 16 Wochen euthanasiert. Post mortem wurden µ-CT-Auswertungen zur
Bestimmung der Menge von neu gebildeten Knochen im Defektbereich durchgeführt.
Des Weiteren wurden immunhistologische Untersuchungen mit CD31-Antikörpern zur Bestimmung der Angiogenese und histologische Färbungen mit Toluidin/ Giemsa zur Ermittlung des neu gebildeten Knochens angefertigt.
Die Vaskularisation konnte bei beiden Trägern durch die Beschichtung mit BMSC gesteigert werden. Durch die Verwendung von VEGF transfizierten BMSC kam es zu einer weiteren signifikanten Zunahme der Gefäßanzahl. Beim Vergleich der beiden Keramiken zeigte sich, dass die Zunahme der Gefäßzahl bei β-TCP signifikant größer als bei CDHA ausfiel.
Die Osteogenese konnte ebenso wie die Vaskularisation bei beiden Trägern durch die Beschichtung mit BMSC gesteigert werden. Durch die Verwendung von VEGF
transfizierten BMSC kam es bei β-TCP zu einer weiteren auffälligen Zunahme der Knochenneubildung, dagegen trat bei CDHA eine signifikante Verringerung der Knochenneubildung auf.
Im Hinblick auf die Umbaukinetik der Keramiken zeigte sich, dass das Ersatzmaterial CDHA mit VEGF transfizierten BMSC signifikant stärker abgebaut wird als das der Vergleichsgruppe mit β-TCP.
VEGF wirkt sich vorteilhaft auf β-TCP aus. Es konnten Vaskularisation und
Osteogenese gesteigert werden. Bei CDHA hat VEGF einen negativen Effekt auf die Osteogenese.
Daraus lässt sich folgern, dass eine Steigerung der Vaskularisation und damit der Osteogenese im Defektbereich durch den Einsatz von VEGF möglich ist. Bei der Wahl des Knochenersatzstoffes muss jedoch auf Wechselwirkungen mit dem Wachstumsfaktor geachtet werden.
7 Summary
Mirjam Beverungen
The effect of the angiogenetic growth factor VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) on vascularisation and osteogenesis in fixed bone graft substitutes.
The reconstruction of large bone defects after fracture or bone resection and so the hazard of the developments of nonunions are a current problem in orthopedic surgery of humans and animals.
In the present study we analysed the influence of VEGF, an angiogenetic growth factor, on angiogenesis and osteogenesis in two different substitutes (β-TCP and CDHA).
For this investigation we used an established radius-defect-model on “New Zealand White Rabbits”. At first we harvested the BMSC from the animals and expanded them in vitro.
36 animals were devided in six treatment groups (β-TCP or CDHA without BMSCs, with BMSC or with VEGF transfected BMSCs). At regular intervals we conducted X-Ray controlls. By using a score for the bone remodeling and resorption of the bone graft substitute the X-Rays were assessed. After 16 weeks the animals were euthanised and µ-CTs of the forearms were used to evaluate the amount of new bone within the defect area. Furthermore immunhistochemical staining of blood vessels with monoclonal mouse anti-human CD31 antibody and a histological staining with Toluidin/Giemsa were used to assess the amount of newly formed vessels and bone was performed.
BMSC improved the vascularisation in both bone graft substitutes. By using VEGF transfected BMSC there was a further significant increase of the amout of blood vessels. Between the substitutes the increase was significantly higher in the β-TCP group.
The osteogenesis, like vascularisation, could be improved by both bone graft substitutes by using BMSC. Animals which received β-TCP with VEGF transfected
BMSC showed a further significant increase of newly formed bone, whereas CDHA with VEGF transfected BMSC showed a significant reduction of new bone formation.
Concerning the kinetic of bone remodelling, a significant higher degradation was seen in the group with CDHA loaded with VEGF transfected BMSC compared to β-TCP with VEGF transfected cells.
VEGF has a favourable effect on β-TCP. In this case we could show an increase of the vascularisation and the osteogenesis. Otherwise VEGF has a detrimental effect on CDHA.
This leads to the conclusion that VEGF is able to increase the vascularisation and osteogenesis in bone defects. By choosing a bone graft substitute you have to consider the interaction with the growth factor.
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