Untersuchung von Protein-Nukleinsäure-Interaktionen

Spezifische und unspezifische Wechselwirkungen zwischen Proteinen und Nukleinsäuren sind ein wichtiger Teil regulatorischer Prozesse innerhalb einer Zelle.

Dadurch wird beispielsweise die Genexpression und andere Stoffwechselvorgänge kontrolliert. Dieser Abschnitt beschäftigt sich mit der quantitativen und qualitativen Messung der spezifischen Sequenzerkennung eines Proteins mit der Nukleinsäure, sowie mit der Identifizierung der Nukleotidsequenz der IolR-Bindestelle mittels Subklonierung in kommerziell erwerbliche Plasmid-Vektoren.

Qualitative Messung der Protein-DNS-Interaktion mittels Gelmobilitätsstudien

Diese Art der Untersuchung von Protein-DNS-Interaktionen beruht darauf, dass ungebundene DNS in einem nativen Gel eine höhere Wandergeschwindigkeit aufweist als proteingebundene DNS, die im Gel zurückgehalten wird. Die zu untersuchenden Promotorregionen von PreiD und PiolE werden mittels PCR amplifiziert und mit dem Kit MSB® Spin PCRapace (250) von Stratec Molecular (Berlin, DE) aufgereinigt. Als Kompetitor wird entweder ein 195 bp oder 312 bp langes Promotorfragment von dem Haushalts (housekeeping) -Gen argS verwendet. Das Gen argS kodiert für eine Arginyl-tRNA Synthetase, welches die Aminosäuren mit ihren spezifischen Arginyl-tRNA-Molekülen kovalent verbindet. Es werden 100 ng bzw. 50 ng der zu untersuchenden DNS mit 4 μl

Material und Methoden

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5 × Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer und mit der gleichen Menge an Kompetitor DNS vermischt und mit steigenden Mengen des aufgereinigten Proteins versetzt. Nun werden die Ansätze durch Zugabe von MilliQ auf ein Gesamtvolumen von 20 μl gebracht und bei RT für 45 Minuten inkubiert. Die Proben werden mit 4 μl 6 × Orange Loading Dye (Thermo Scientific, St. Leon-Rot, DE) vermischt und auf ein natives 9,5-prozentiges Polyacrylamidgel aufgetragen (s. Tab. 8). Die Auftrennung erfolgt bei 120 V und 4 °C für ungefähr 2 Stunden. Das Gel wird mit GelRed für 20 Minuten gefärbt und im Anschluss werden die DNS-Banden mit dem UV-Transilluminator UVsolo TS von Biometra (Göttingen, DE) sichtbar gemacht.

Tab. 8: Zusammensetzung eines nativen Polyacrylamidgels für zwei Gele

9,5-prozentiges natives Polyacryamidgel (für 2 Gele) Acrylamidlösung (30 %) 4,8 ml

TBE (5 ×) 3 ml

MilliQ 7 ml

APS (10 %) 150 μl

TEMED 15 μl

Quantitative Messung der Protein-DNS-Interaktion mittels SPRS

Die Surface Plasmon Resonance Spectoscopy (SPR-Spektoskopie) ermöglicht die Untersuchung direkter Interaktionen zwischen verschiedenen Makromolekülen z.B.

einem Protein und seinem Bindesequenzmotif auf der DNS. Eine spezifische biologische Bindungsreaktion kann in Echtzeit in Hinsicht ihres Gleichgewichts- und Geschwindigkeitskonstanten näher charakterisiert werden. Dies ermöglicht molekularbiologische Prozesse des jeweiligen Proteins und deren regulatorische Funktion innerhalb einer Zelle genauer zu betrachten.

Die Proteine werden wie bereits beschrieben aufgereinigt (s. 2.3.1.2) und die DNS-Fragmente der iol-Promotoren mittels biotinylierter Oligonukleotiden (s. Tab. 21) amplifiziert. Als Kontrolle dienen biotinylierte Oligonukleotide der Promotorregion des pcfA Gens von Photorhabdus luminescens, diese werden zusammen für fünf Minuten bei 100 °C zu doppelsträngiger DNS verbunden. Anschließend werden die Untersuchungen in Kooperation mit Dr. Ralf Heermann von der Ludwig-Maximilians-Universität München mit einem Biacore T200 Gerät (GE Healthcare, Freiburg, DE) und einem Streptavidin-beladenem SAD500-L Carboxymethyl dextran Sensorchip (XanTec

Material und Methoden

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Bioanalytics GmbH, Düsseldorf, DE) durchgeführt. Alle Experimente werden bei 25 °C mit HBS-EP+ Puffer (100 mM HEPES pH 7,4; 150 mM NaCl, 3 mM EDTA und 0,05 % (v/v) Detergenz P20) ausgeführt. Die Equilibrierung der Sensoroberfläche findet durch dreimalige Injektion von einer Equilibrierungslösung (1 M NaCl und 50 mM NaOH) mit einer Flussrate von 10 µl/min statt. Anschließend werden 10 nM der doppelsträngigen biotinylierten DNS-Fragmente in HBS-EP+ Puffer für 180 Sekunden und einer Flussrate von 10 µl/min in die mobile Phase gegeben. Durch einen Waschschritt mit einer Waschlösung (1 M NaCl, 50 mM NaOH und 50 % (v/v) Isopropanol) wird die Sensoroberfläche von ungebundenen biotinylierten DNS-Fragmenten befreit. Die erste Flusszelle dient als Referenzzelle und wird nicht mit DNS bestückt, um Hintergrundsignale des Refraktionsindex auszuschließen. Nach jedem Zyklus mit unterschiedlicher Proteinmenge, die sich innerhalb eines Konzentrationsbereiches von 0,5 nM bis 2 µM befindet, wird die Sensorchipoberfläche durch eine Injektion von 2,5 M NaCl für 60 Sekunden mit einer Flussrate von 30 µl/min regeneriert. Die Sensogramme werden mit der Biacore T200 Control Software 2.0 aufgenommen und mit der Biacore T200 Evaluation Software 2.0 analysiert (GE Healthcare, Freiburg, DE). Um die Konzentration des Analyten in der Probe zu bestimmen wird eine kalibrierungsunabhängige Konzentrationsbestimmung (calibration-free concentration analysis, CFCA) nach Herstellerangaben von GE Healthcare examiniert. Die Konzentration leitet sich dabei aus dem Diffusionskoeffizienten des Analyten zusammen mit seiner Affinitätsrate unter partiell diffusionslimitierenden Bedingungen ab und kann direkt durch die Protein-DNS-Interaktion im BiaCore-Gerät gemessen werden. Der Diffusionskoeffizient des Proteins wird mittels Biacore diffusion constant calculator and converter webtool (https://www.biacore.com) gemessen und beträgt D = 9,946 × 10

-11 m²/s bei der Annahme eines globulär geformten Proteins. Für die kalibrierungsunabhängige Konzentrationsbestimmung werden 50 nM des aufgereinigten Proteins schrittweise verdünnt (1:2, 1:5, 1:10 und 1:20) und jede Probe zweimal injiziert.

Die initiale Bindungsrate (dR/dt) wird bei zwei verschiedenen Flussraten von 5 µl/min und 100 µl/min in Abhängigkeit der Diffusionskonstanten des Proteins gemessen. Der Wert der „aktiven“ Proteinkonzentration wird für die Berechnung der Gleichgewichtskonstanten und Affinität verwendet. Im weiteren Verlauf wird anhand der gewonnenen Daten ein Interaktionsmodell (Interaction Map, IM) mittels mathematischer Evaluierung über den Ridgeview Diagnostic Server (Ridgeview Diagnostics, Uppsala, Schweden) angefertigt. Hierfür werden Sensogramme aus der Biacore T22 Evaluation

Material und Methoden

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Software 1.0 als *.txt Dateien exportiert und in die TraceDrawer Software 1.5 (Ridgeview Instruments) importiert. Eine Funktion innerhalb der Software ermöglicht die Generierung von bestimmten Dateiformaten, die an den Server von Ridgeview Diagnostics übermittelt werden (im@ridgeviewdiagnostics.com), um die Kalkulation einer InteractionMap durchzuführen. Die Dateien der IM-Analyse werden mit Hilfe der TraceDrawer 1.5 Software analysiert. Für die weitere Auswertung wird ein OneToTwo Algorithmus innerhalb der TraceDrawer Software (Ridgeview Diagnostics AB, Uppsala, Schweden) verwendet, da dieses Modell die beste Anpassung an die empirischen Daten ermöglicht.

Ergebnisse

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