Effiziente Überexpression des Aktivators mittels pBAD-Vektorsystem im Arabinose-

Um ReiD in großen Mengen zu isolieren, wurden die bereits vorliegenden Expressionsvektoren pBAD-Myc/HisC-reiD und pET28-reiD verwendet (s. Tab. 4).

Zusätzlich zum pET28b-Vektor musste pTARA mit in die Salmonellen eingebracht werden, welches ein Gen für die T7-Polymerase enthält und unter der Kontrolle des Arabinosepromotors steht. Da Arabinose als Induktor für die Expression der Plasmide pBAD-Myc/HisC-reiD und pTARA verwendet werden musste, wurden zwei Deletionsmutanten erstellt, denen die Fähigkeit zum Abbau von Arabinose fehlte. Dafür wurden zwei Gene des ara-Operons für die Deletionsmutagenese ausgewählt, die bei der Verstoffwechselung der Arabinose eine zentrale Rolle spielen. Das Gen araA kodiert für das erste von drei Arabinose-abbauende Enzymen und das Gen des Regulators AraC, der als Sensor für die Arabinosekonzentration die Expression von araB, araA und araD kontrolliert. Durch die Deletion dieser beiden Gene soll eine effiziente Induktion des pBAD-Vektors durch Arabinose ermöglicht werden, da dieser Zucker nicht mehr von den Bakterien verstoffwechselt werden kann.

Mit Hilfe der Phagentransduktion wurde die Kanamycin-Resistenzkassette mit den flankierenden Bereichen der beiden Gene araA bzw. araC durch homologe Rekombination in das Salmonella Genom eingebracht. Durch eine Passage auf Indikatorplatten (green plates) mit 50 µg/ml Kanamycin wurden die Bakterien mit erfolgreicher Insertion anhand der Resistenzausbildung selektiert. Durch die dem Agar zugesetzten pH-Farbindikatoren können infizierte Bakterien anhand ihrer Koloniefarbe erkannt werden: dunkelgrüne Kolonien mit niedrigen pH-Wert zeigten eine fortgeschrittene Zelllyse infolge einer Phageninfektion an und weiße Kolonien enthielten

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keine lytischen Phagen mehr. Durch eine weiterführende Passagierung weißer Kolonien auf Indikatorplatten wurden die Bakterien von den Phagen befreit. Ein Überkreuzausstrich diente als Nachweis für die Befreiung der Bakterien von lysogenen Phagen (s. Abb. 26). Für diesen Ausstrich wurden weiße Kolonien der zu testenden Deletionsmutanten, der Stamm 14028 als Positiv-Kontrolle und eine noch mit Phagen infizierte dunkelgrüne Kolonie von einer früheren Passage als Negativ-Kontrolle verwendet. Diese Stämme wurden auf einer Indikatorplatte mit einer vertikal verteilten P22-Phagensuspension ausgestrichen, so dass die Bakterien diese durchkreuzten und erneut den Phagen ausgesetzt wurden. Bakterien, die nicht frei von Phagen sind, zeigen eine Resistenz gegenüber einer erneuten Infektion und sind an einem ausbleibenden Farbumschlag in Form von weißen Kolonien zu erkennen. Nach der Inkubation des Ausstriches wurde eine Infektion der Deletionsmutanten und 14028, in Form von dunkelgrünen Kolonien angezeigt (s. Abb. 26). Die Negativ-Kontrolle zeigte, dass der Bakterienstamm bereits mit Phagen infiziert war, bevor die Zellen mit den Phagen erneut in Kontakt kamen.

Abb. 26: Kontrolle auf phagenfreie Arabinose-defiziente Salmonellen nach der Phagentransduktion mittels Überkreuzausstrich. Der Wildtypphage P22 wurde in vertikaler Richtung mittig auf einer Indikatorplatte aufgetragen und die zu testenden Kolonien von links nach rechts durch die Phagensuspension gestrichen.

Als Kontrolle diente der Bakterienstamm 14028 und eine grüne noch mit Phagen infizierte Kolonie. Von der durchgeführten Phagentransduktion wurden je zwei Kandidaten von 14028 ΔaraA und 14028 ΔaraC getestet.

Durch den Überkreuzausstrich wurde je ein Kandidat des Stammes 14028 ΔaraA bzw.

14028 ΔaraC ausgewählt, die für die folgende Transformation mit dem pCP20 Plasmid verwendet wurden. Nach dem Herausschneiden der Resistenzkassette wurde die erfolgreiche Deletion von araA und araC mittels PCR überprüft (s. Abb. 27).

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Abb. 27: Nachweis der Deletion der Gene araA und araC mittels PCR. Getestet wurden die ausgewählten Kandidaten für die Deletion des araA- (1-4) bzw. araC-Gens (5-8). Als Kontrolle dienten die Negativkontrollen (1, 5), der Stamm 14028 mit intakten ara-Genen (2, 6), 14028 araA::Kan^R (3) und 14028 araC::Kan^R (7). Die zu testenden Deletionsmutanten waren 14028 ΔaraA (4) und 14028 ΔaraC (8). Ein Marker (M) wurde mit aufgetragen.

Der Bakterienstamm 14028 mit intaktem araC wurde als Kontrolle mitgeführt und das PCR-Amplifikat wies eine Länge von 1145 bp auf (s. Abb. 27 Proben-Tasche 6). Durch die Insertion der Kanamycin-Resistenz-Kassette und die Verwendung der gleichen Oligonukleotide wurde ein längeres Fragment von 1833 bp nachgewiesen (s. Abb. 27 Proben-Tasche 7). Nach dem Herausschneiden der Resistenzkassette blieb ein Fragment mit der Länge von 442 bp übrig (s. Abb. 27 Proben-Tasche 8). Da ein Nachweis der Deletion des araA-Gens auch nach Verwendung anderer Primer nicht funktionierte, wurde die Deletion des Gens durch ihr Wachstums-Defizit in MM mit 1 % L-Arabinose nachgewiesen. Die beiden Stämme wurden anschließend mit den Plasmiden pBAD-Myc/HisC-reiD bzw. pET28b-reiD und pTARA transformiert und mittels PCR auf dessen Anwesenheit getestet.

Um die Bakterienstämme auf eine erfolgreiche Produktion von ReiD zu überprüfen, wurden diese auf eine induzierbare Überexpression des Aktivators getestet. Dafür wurden sowohl die Salmonella Stämme mit Arabinose-defizienten Hintergrund, als auch die Ausgangsstämme E. coli BL21(DE3) pET28b-reiD und E. coli TOP10 pBAD-Myc/HisC-reiD als Kontrollen mitgeführt. Die Stämme wurden in LB-Medium angezogen und die Proteinexpression nach drei Stunden bei 37 °C induziert. Es wurden vor der Induktion, zwei und vier Stunden nach der Induktion und am nächsten Morgen jeweils Proben für die SDS-PAGE entnommen und die Proteine mit einer Coomassie-Färbung sichtbar gemacht (s. Abb. 28).

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Abb. 28: Überexpression von ReiD-His6 mittels pET28b-reiD und pTARA. A) Kontrollproben aus E. coli BL21(DE3) pET28b-reiD vor der Induktion (1), zwei Stunden (2) bzw. vier Stunden nach der Induktion (3) und über Nacht (4). B) Proben von 14028 ΔaraA bzw. ΔaraC pET28b-reiD pTARA vor der Induktion (1,5), zwei Stunden (2,6) bzw. vier Stunden nach der Induktion (3,7) und über Nacht (4,8). Ein Marker (M) wurde mit aufgetragen.

Bei der Verwendung des pET28b-Vektorsystems zeigte der E. coli Stamm eine Induktion der Überexpression nach zwei Stunden, die durch eine Bande auf der Höhe von etwa 35 kDa sichtbar wurde (s. Abb. 28 A Proben-Tasche 2). Es wurde keine Überexpression in den Arabinose-defizienten Salmonella Stämmen durch eine derartige Bande erkannt (s. Abb. 28 B Proben-Tasche 2 - 4 bzw. 6 - 8). Währenddessen zeigte S. Typhimurium 14028 ΔaraA pBAD-Myc/HisC-reiD bereits zwei Stunden nach der Induktion eine deutliche Überexpression (s. Abb. 29 B Proben-Tasche 2), die vergleichbar mit der Expression in E. coli TOP10 war (s. Abb. 29 A Proben-Tasche 2).

Abb. 29: Überexpression von ReiD-His6 mittels pBAD-Myc/HisC-reiD. A) Kontrollproben aus E. coli TOP10 pBAD-Myc/HisC-reiD vor Induktion (1), zwei Stunden nach Induktion (2), vier Stunden nach Induktion (3) und über Nacht (4). B) Proben von 14028 ΔaraA bzw. ΔaraC pBAD-Myc/HisC-reiD vor der Induktion (1,5), zwei Stunden nach der Induktion (2,6), vier Stunden nach der Induktion (3,7) und über Nacht (4,8).

Ein Marker (M) wurde mit aufgetragen.

Die induzierten Proben aus E. coli TOP10 und der araA-Deletionsmutante wiesen eine Bande hoher Intensität bei etwa 35 kDa auf (s. Abb. 29 Proben-Tasche 2 bis 4). Bereits in der uninduzierten Probe von E. coli TOP10 wurde eine stärkere Bande auf derselben Höhe beobachtet. In der araC-Deletionsmutante war die Bande nur schwach erkennbar,

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wobei die Bandenintensität und die damit einhergehende Proteinmenge auch nach längerer Zeit nicht zunahm (s. Abb. 29 B Proben-Tasche 6 - 8). Aus diesem Grund wurde für die weiteren Untersuchungen S. Typhimurium ΔaraA pBAD-Myc/HisC-reiD als Expressionsstamm für die Isolation von ReiD ausgewählt.

3.5.2. Aufreinigung und Rückfaltung des Aktivators unter denaturierenden