Überprüfung der Funktionalität des Aktivators mittels Gelmobilitätsstudien

Promotorregionen des reiD- und iolE-Promotors zu binden, mittels Gelmobilitätsstudien überprüft. Hierzu wurden die Promotorfragmente von reiD, iolE und argS als Negativ-Kontrolle mittels PCR amplifiziert und aufgereinigt. Für die Bestimmung des molaren Überschusses des Proteins gegenüber der eingesetzten DNS wurde der Quotient aus den berechneten Stoffmengen aus Formel 6 und 7 berechnet. Für jeden Ansatz wurden 50 ng an DNS eingesetzt, mit steigender Proteinmenge versetzt und für 45 Minuten bei RT inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf einem nativen Polyacrylamid-Gel bei 4 °C aufgetrennt (s. Abb. 31). Als Negativ-Kontrollen diente die Zugabe des argS-Promotorfragmentes und eine Probe ohne Proteinzusatz.

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Abb. 31: Promotorbindeaktivtät von ReiD nach Aufreinigung unter denaturierenden Bedingungen und anschließender Rückfaltung. Die Gelmobilitätsstudien wurden entweder mit rückgefalteten Protein über Dialyse (A, B) oder Filtration (C, D) durchgeführt. Je 50 ng Kompetitor DNS und 50 ng DNS von PiolE (A, C) oder PreiD (B, D) wurden mit steigender Menge von ReiD versetzt, inkubiert und aufgetragen.

Anschließend wurde die DNA mit einer GelRed-Färbelösung sichtbar gemacht.

Eine Bindung von ReiD an die Promotorfragmente von reiD und iolE wurde weder nach Rückfaltung durch Dialyse noch nach Filtration nachgewiesen. Die Bandenintensität der Promotorfragmente nahm zwar bei hoher Proteinmenge ab, aber eine Bande für den sich bildenden Protein-DNS-Komplex wurde nicht identifiziert. Eine Abnahme der Bandenintensität war auch bei höherer Proteinmenge der Negativ-Kontrolle PargS zu beobachten. Das aufgereinigte ReiD zeigte keine Bindungsaktivität an die von ihm kontrollierten Promotoren, wodurch auf eine nicht korrekte Rückfaltung des Proteins zu schließen ist. Um weitere Versuche zur Funktionalität des Aktivators durchführen zu können, müssen die Bedingungen der Rückfaltung weiter optimiert werden.

Schlussfolgerung: Charakterisierung der phänotypischen Heterogenität während der iol-Genexpression und der Einfluss des Regulators IolR Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit mehrere Beobachtungen über die Expression der iol-Gene und deren Regulation, zur Anpassung der Salmonellen an sich verändernde Umweltbedingungen gemacht. Unter anderem wurde die iol-Genexpression unter Bedingungen mit MI untersucht und zeigte, dass die Expression der Gene für die abbauenden Enzyme, sowie die Regulatoren während der Anlaufphase in einem Teil der Population induziert wurden und die Salmonellen im weiteren Verlauf vermehrt ihren Stoffwechsel auf diese Kohlenstoff- und Energiequelle umstellten. Das Expressionsverhalten dieser Gene der genomischen Insel GEI4417/4436 war innerhalb

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der Population in Anwesenheit von MI von Bistabilität geprägt, wodurch sich zwei Phänotypen bei gleichem Genotyp ausbildeten. Der eine Teil der Population befand sich in einem aktiven Zustand für die MI-abbauenden Gene und die andere Subpopulation verblieb inaktiviert. Die Varianz der Merkmalsausprägung zeigte eine heterogene Population in Hinsicht auf die iol-Genexpression während des Abbaus des Substrates, die nach anfänglichen Schwankungen zunehmend einheitlicher verlief. Wurden die Salmonellen an eine Umgebung mit dem Polyol adaptiert, zeigten sie bei einem Wechsel der Umgebungsbedingungen in nährstoffreichen Medium einen graduellen Gedächtnisverlust. Das Gedächtnis der Bakterien manifestiert sich durch die andauernde Transkription der Gene für die MI-abbauenden Enzyme innerhalb der Zelle in Abwesenheit des induzierenden Stimulus. Ein Teil der Salmonella-Population konnte diesen Zustand für 4 Stunden aufrechterhalten, wobei die transkriptionelle Aktivität des iolE-Gens stetig abnahm. Ein Einfluss des Repressors auf die Hysterese wurde nicht beobachtet. Die Bakterien waren somit in der Lage, ihren Stoffwechsel schnell an die neuen Umgebungsbedingungen anzupassen. Dennoch blieb 0,1 % der Population in einem aktiven Zustand für den Abbau von MI, trotz negativen Auswirkungen auf deren Selektion. Die Stämme mit induzierter iol-Genexpression zeigten eine reduzierte Wachstumsgeschwindigkeit von 15,4 – 27,0 % unter optimalen Inkubationsbedingungen im Vergleich zum parenteralen Stamm. Es wurde nachgewiesen, dass das Überleben der Art, durch die zusätzlich aufgewendete Energie für die Expression der iol-Gene unter nicht induzierenden Bedingungen, gefährdet ist. Bei erneuter Anwesenheit von MI in der Umgebung zeigten die Zellen mit aktiven Zustand der iol-Genexpression einen Wachstumsvorteil, wodurch sich das Aufrechterhalten der zusätzlichen Expression der MI-abbauenden Gene positiv auf die Selektion auswirkte. Die Regulatoren der genomischen Insel GEI4417/4436 sind von zentraler Bedeutung für die Aufklärung des Regulationsmechanismus. Durch die nähere Betrachtung der Interaktion des Repressors mit den iol-Promotoren wurde herausgefunden, dass er mit zwei Bindestellen innerhalb der Promotorregion der iol-Gene interagiert und diese von unterschiedlichen Affinitäten geprägt waren, aber gleichermaßen von IolR gebunden wurden. Die Affinitäten wurden für die iol-Promotoren PiolR, PreiD und PiolT1 bestimmt und befanden sich unabhängig von der jeweiligen Bindestelle im nanomolaren Bereich. Während der Untersuchung der Protein-DNS-Interaktion wurden Hinweise auf eine möglich stattfindende Oligomerisierung des Repressors gefunden. Es wurde versucht die Nukleotidsequenz der IolR-Bindestelle mittels eines abgewandelten DNA-Protektionsexperiment und

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anschließender Subklonierung zu identifizieren. Es wurde jedoch kein DNS-Fragmentes im inaktivierten Reaktionsansatz für die nachfolgende Anwendung detektiert und die sequenzierten Vektoren wiesen keine Insertion einer Nukleotidsequenz auf. Für die Untersuchung des Aktivators des MI-Metabolismus wurde ein effizientes Überexpressionssystem mit Hilfe des pBAD-Vektorsystems in Arabinose-defizienten Salmonellen entwickelt. Durch eine Aufreinigung von ReiD unter denaturierenden Bedingungen und der Verwendung des ÄKTA-Systems wurde eine hohe Reinheit und Menge des Aktivators erzielt. Durch eine vermehrte Kristallbildung, bei der anschließend durchgeführten Dialyse, war eine Rückfaltung und die damit einhergehende Wiederherstellung der Funktionalität des Aktivators problematisch. Es wurde keine Bindung von ReiD an seine Zielstrukturen PiolE und PreiD beobachtet. Die Bedingungen der Rückfaltung des Proteins müssen an dieser Stelle weiter optimiert werden.

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