Besonderheiten während des Wachstums von Salmonellen mit myo-Inositol

Kohlenstoff- und Energiequelle ist von mehreren Merkmalen geprägt. Bei der Kultivierung von S. Typhimurium in flüssigem MM mit MI wurde eine lange Anlaufphase von 40 bis 60 Stunden dokumentiert, die unter den gleichen experimentellen Bedingungen mit einer sehr hohen Variabilität unterlag (Kröger & Fuchs, 2009). Beim Eintritt der bakteriellen Kultur in die stationäre Wachstumsphase ist eine Braunfärbung des Medium zu erkennen, die nur bei Anwesenheit von Sauerstoff auftrat (Old, 1972;

Kröger &Fuchs, 2009). Zusätzlich wurde ein außergewöhnlich heterogener Phänotyp auf festem Medium mit MI erkannt, der sich in Form von schnellwachsenden Kolonien im Vordergrund und langsam wachsenden Kolonien im Hintergrund zeigte (Kröger et al., 2011). Bei erneuter Passagierung der sich unterscheidenden Phänotypen auf festem Medium mit dem Polyol wurde nur für die langsam wachsenden Kolonien eine phänotypische Heterogenität beobachtet, wohingegen die schnellwachsenden Kolonien einen einheitlichen Phänotyp zeigten. Eine Revision zum heterogenen Phänotyp erfolgte durch drei Passagen in LB-Medium, wodurch dieses Phänomen nicht auf eine genetische Mutation zurückzuführen ist. Des Weiteren deutet dieses Ergebnis auf ein Gedächtnis der Zellen in Abwesenheit von MI hin. Die Länge der Anlaufphase während des Wachstum in MI wurde durch die Deletion des Repressors IolR oder in Anwesenheit von 0,55 % Kohlenstoffdioxid, sowie durch Induktion der Gene iolE, iolG oder reiD reduziert (Kröger et al., 2011; Rothhardt et al., 2014). Durch Untersuchungen auf Einzelzellebene konnte die phänotypische Heterogenität von S. Typhimurium auf die bistabile Aktivität des iolE-iolG1-Operon während des Wachstums mit MI innerhalb der Population zurückgeführt werden (Kröger et al., 2011). Das iolE-iolG1 Operon kodiert die Enzyme IolE und IolG1, die die initialen enzymatischen Schritte des MI-Abbaus katalysieren.

Mittels Durchflusszytometrie wurde ein gradueller Wechsel der transkriptionellen Aktivität des iolE-Gens in MM mit MI beim Übergang der Anlaufphase in die logarithmische Wachstumsphase in einer Subpopulation nachgewiesen (s. Abb. 4). Es wurden unterschiedliche Ausprägungen der iolE-Transkription innerhalb der Population beobachtet. Entweder wiesen die Zellen keine, eine geringe oder eine hohe PiolE- Aktivität während des Wachstums mit MI auf.

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Abb. 4: Analyse der transkriptionellen Aktivität des iolE-Promotors mittels Durchflusszytometrie. Gemessen wurde S. Typhimurium 14028 pNT-PiolE in MM mit MI. Die gfp-exprimierenden Zellen wurden mit dem LSR II Zytometer quantifiziert. Die Abszisse des Histogramms repräsentiert die Fluoreszenzintensität des Gfp-Proteins bei 515 bis 545 nm in logarithmischer Skalierung und die Ordinate die gemessenen Zellen.

Die Zeitpunkte und die Werte der optischen Dichte bei 600 nm sind mitangegeben. Die Wachstumskurve wurde zur Identifizierung der Wachstumsphase der bakteriellen Kultur mit abgebildet (Kröger et al., 2011).

Auf Grund dieser Beobachtungen wurde ein vorläufiges Modell für die Regulation des MI-Metabolismus in S. Typhimurium 14028 postuliert. Durch die basale Expression des Haupttransporters ist eine geringe Menge an IolT1 in der bakteriellen Zellmembran vorhanden. In Anwesenheit von MI wird der Zucker über IolT1 in das Zytosol der Zelle transportiert und zu DKGP abgebaut. Das Intermediat bindet an IolR, so dass der Repressor von den iol-Promotoren ab dissoziiert. Ist ein bestimmter Grenzwert von DKGP erreicht kann die Repression nicht mehr aufrechterhalten und die iol-Genexpression durch den Aktivator ReiD mit einer positiven Rückkopplungsschleife vermehrt induziert werden (Rothhardt et al., 2014). Durch suboptimale Mengen des Intermediates wird die Expression nicht einheitlich innerhalb der Population induziert, wodurch eine Bistabilität in Erscheinung tritt (Kröger et al., 2011).

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18 Phänotypische Heterogenität

Um ökologische Nischen erfolgreich zu besetzen müssen Bakterien in der Lage sein, sich an viele verschiedene Bedingungen anzupassen, z.B. pH-Wert, Osmolarität, Temperatur, Nährstoffverfügbarkeit und mikrobielle Konkurrenz. Die Fähigkeit der Adaptation wird durch die genetische Kapazität der Bakterien begrenzt, so dass regulatorische Mechanismen und genetische Netzwerke entwickelt wurden, um auf eine vielfältige Weise auf die Umwelt zu reagieren. Dadurch werden die zur Verfügung stehenden Ressourcen optimal genutzt und das Überleben der Spezies gesichert. Dank einer beständigen Entwicklung neuster Technologien auf dem Gebiet der Einzelzellanalyse konnten mittels Durchflusszytometrie oder Fluoreszenzmikroskopie einzelne Zellen innerhalb einer Population analysiert und eine ungewöhnliche Variation innerhalb einer Merkmalsausprägung aufgedeckt werden (Ozbudak et al., 2002; Elowitz et al., 2002).

Bis zu diesem Zeitpunkt wurde angenommen, dass in einer isogenen Population die Genaktivität einheitlich ist. Untersuchungen zeigten jedoch, dass genetisch identische Zellen sich unter denselben Bedingungen unterschiedlich verhalten. Dieses Phänomen wurde als phänotypische Heterogenität beschrieben und geht auf genetische Veränderung z.B. adaptive Mutagenese oder Phasenvariation (Moxon et al., 1994) und auf einen nicht genetischen Ursprung, wie epigenetische Modifikation der DNS-Methylierung (Low et al., 2001; Bennett & Hasty, 2007; Casadesús & Low, 2013), Zellzyklus-abhängige Variation oder auf das Alter der Zellpole zurück (Bergmiller & Ackermann, 2011). Die Genregulation über Rückkopplungsmechanismen stellt einen weiteren Mechanismus unabhängig von genetischen Veränderungen dar (Ferrell, 2002;

Smits et al., 2008). Durch diese Vorgehensweise der Bakterien werden verschiedene Nachkommen bzw. Phänotypen aus einer Generation hervorgebracht, die zwar genetisch identisch sind, sich aber in ihrer Anpassung an die Umwelt unterscheiden. Diese Strategie wird als „bet-hedging“ bezeichnet und stellt durch Ausbildung mehrerer Varianten eine Art Risikostreuung der Bakterien dar (Philippi & Seger, 1989). Ein Teil der Population hat unter gleichbleibenden Bedingungen zwar geringere Überlebenschancen, aber der Fortbestand der eigenen Art ist in einer sich schnell ändernden Umwelt, in der eine Anpassung über Regulation der Genexpression zu langsam wäre, gesichert (Veening et al., 2008b; Ackermann, 2015).

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