Untersuchung der Substratspezifität und Struktur-Wirkungs-Beziehungen der CbHST und der CbRAS

3.5.2. Untersuchung der Substratspezifität und Struktur-Wirkungs-Beziehungen

Die CbHST akzeptiert lediglich Shikimisäure als Akzeptorsubstrat. pHPL, DHPL und Chinasäure werden auch bei verlängerter Inkubationszeit und sehr hohen Enzymkonzentrationen nicht umgesetzt. Daher ist die CbHST eine „reine“ HST mit hoher Substratspezifität für den Akzeptor Shikimat.

3.5.2.2. Untersuchung der Substratspezifität der CbHST II

Wie in Kapitel 3.5.2.1 beschrieben, handelt es sich bei dem durch die klonierte cDNA codierten Enzym um eine reine HST, die p-Cumaroyl-CoA und Caffeoyl-CoA effizient auf Shikimat, nicht aber auf Chinat oder pHPL/DHPL überträgt. Es sollte nun genauer untersucht werden, ob es sich bei der CbHST um ein spezifisches Enzym der Monolignolbiosynthese handeln kann. Daher wurden weitere CoA-aktivierte Säuren und Akzeptoren angeboten. Es wurde viel (170 µg/ml) Enzym verwendet und die Ansätze jeweils lange (30 min) inkubiert.

Von BAHD-Acyltransferasen werden die CoA-aktivierten Säuren Acetyl-CoA, Malonyl-CoA, Benzoyl-CoA, Anthraniloyl-CoA und die fünf Hydroxycinnamoyl-CoAs, pC-CoA, Caf-CoA, Cin-CoA, Fer-CoA und Sin-CoA auffallend häufig übertragen.

Es wurde untersucht, ob diese CoA-Aktivierten Säuren von der CbHST auf das schon bekannte Akzeptormolekül Shikimisäure übertragen werden. Nur die Hydroxycinnamoyl-CoAs wurden als Substrate akzeptiert. Bei keinem der anderen CoA-aktivierten Säuren konnte eine Produktbildung beobachtet werden. Daraus lässt sich schließen, dass die CbHST hinsichtlich der CoA-aktivierten Säuren spezifisch für Phenylpropensäuren ist.

Innerhalb der Superfamilie der BAHD-Acyltransferasen ist eine enorme Anzahl von sehr verschiedenen Akzeptoren bekannt (siehe Kapitel 1.5). Die Auswahl an putativen Akzeptorsubstraten musste eingeschränkt werden. Es wurden solche Akzeptorsubstrate getestet, die von anderen bekannten Hydroxycinnamoyltransferasen übertragen werden. Die entsprechenden Strukturformeln sind in Kapitel 3.6.2 zusammengefasst. Serotonin N-HCTs, Tyramin N-HCTs, Hydroxyanthranilat N-HCTs, Anthranilat N-Benzoyltransferasen, Anthocyanin-Hydroxycinnamoyltransferasen und die N-HCBTs sind bekannt (siehe Kapitel

3.6). In vielen Fällen handelt es sich um N-Hydroxycinnamoyltransferasen bzw.

N-Benzoyltransferasen.

Die Akzeptorsubstrate Anthranilsäure, 3-Hydroxyanthranilsäure, Tyramin, Tryptamin, Serotonin, Dopamin, L-DOPA und 2-Phenylethylamin wurden der CbHST in Kombination mit p-Cumaroyl-CoA angeboten. Bei keinem der getesteten Akzeptoren außer 3-Hydroxy-anthranilsäure konnte eine Produktbildung beobachtet werden. Es ist ungeklärt, ob die Säure

auf die Hydroxylgruppe oder auf die Aminogruppe der 3-Hydroxyanthranilsäure übertragen wird. Der entsprechende Produktpeak wurde mittels HPLC aufgereinigt und durch Massenspektroskopie analysiert sowie ein ¹H-NMR-Spektrum aufgenommen. Beide Analysen kamen zu dem Ergebnis, dass das gebildete Produkt ein Kondensat aus pC-CoA und 3-Hydroxyanthranilsäure ist. Ob es sich allerdings um den Ester oder um das Amid handelt, konnte ohne Referenz nicht gezeigt werden. Ein enzymatischer Umsatz von 3-Hydroxyanthranilsäure mit Caf-CoA, Cin-CoA, Fer-CoA und Sin-CoA konnte ebenfalls beobachtet werden.

3.5.2.3. Strukturelle Erfordernisse der Akzeptorsubstrate der CbHST

Weiterführende Untersuchungen zu Akzeptorsubstraten deuten an, dass es sich bei dem gebildeten Kondensat aus pC-CoA und 3-Hydroxyanthranilsäure wahrscheinlich um den Ester handelt. Die im Folgenden genannten Akzeptoren wurden aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu 3-Hydroxyanthranilsäure ausgewählt. Sie sind keine Intermediate im pflanzlichen Sekundärstoffwechsel.

Zunächst wurde getestet, ob die CbHST 2,3-Dihydroxybenzoesäure als Akzeptorsubstrat umsetzt. In diesem Molekül ist die Aminogruppe der 3-Hydroxyanthranilsäure durch eine

Hydroxylgruppe ersetzt. Im CbHST-Enzymtest mit p-Cumaroyl-CoA und 2,3-Dihydroxybenzoesäure wurde eine Produktbildung beobachtet. Nach enzymatischer

Hydrolyse des Produktpeaks (siehe Kapitel 2.4.8) konnten p-Cumarsäure und 2,3DiOHB gegen authentische Referenzsubstanzen mittels HPLC-Analyse identifiziert werden. Da auch

in Abwesenheit einer Aminogruppe eine Reaktion stattfindet, kann in Bezug auf 3-Hydroxyanthranilsäure gefolgert werden, dass wahrscheinlich keine Amidbildung in

ortho-Position erfolgt.

3-Hydroxybenzoesäure wurde ausgewählt, um zu untersuchen, ob die Kondensation in meta-Position stattfindet. Tatsächlich wird der Ester aus 3-Hydroxybenzoesäure und pC-CoA gebildet. Dieses Ergebnis unterstützt die Schlussfolgerung bezüglich der Amidierung in ortho-Position: Die CbHST setzt Akzeptoren um, die in meta-Stellung zur Carboxylgruppe eine Hydroxylgruppe besitzen. Eine Tatsache, die dieses Ergebnis untermauert, ist die Veresterung in meta-Position beim natürlichen Substrat Shikimisäure.

Da viele N-Hydroxycinnamoyltransferasen bekannt sind; sollte untersucht werden, ob die

CbHST auch Amidbindungen knüpfen kann. Wurden ihr 3-Aminobenzoesäure und

werden. Die CbHST kann Amidbindungen knüpfen, allerdings sehr schlecht. Neben pC-CoA wurden von der CbHST auch Caf-CoA, Cin-CoA und Fer-CoA, nicht aber Sin-CoA mit 3-Hydroxybenzoesäure, 2,3-Dihydroxybenzoesäure und 3-Aminobenzoesäure kondensiert.

Um zu beweisen, dass die Carboxylgruppe essentiell für die Reaktion und damit für die Bindung im aktiven Zentrum ist, wurde der CbHST Phenol angeboten. Dieser Nachweis gelang, denn mit Phenol wurde keine Enzymreaktion beobachtet.

3-Hydroxyanthranilsäure und 2,3-Dihydroxybenzoesäure sind sehr gute Substrate. Unter

Standardbedingungen (siehe Kapitel 2.2.4) können Produktpeaks detektiert werden.

3-Hydroxybenzoesäure und 3-Aminobenzoesäure werden sehr schlecht umgesetzt. Nur unter Einsatz großer Enzymmengen und drastischer Verlängerung der Inkubationszeit sind Reaktionsprodukte zu erkennen.

Eine Übersicht über die getesteten Substrate und die Substratspezifität der CbHST befindet sich in Kapitel 3.6.2 . Die HPLC-Chromatogramme mit Positiv- und Negativkontrolle für Reaktionsprodukte ohne Referenzsubstanz befinden sich im Anhang.

3.5.2.4. Untersuchung der Substratspezifität der CbRAS I

Berger et al. (2006) hatten gezeigt, dass die heterolog exprimierte RAS aus Coleus blumei pC-CoA und Caf-CoA auf pHPL und DHPL überträgt. Shikimisäure und Chinasäure sind keine Substrate.

Dieses Ergebnis konnte bestätigt werden. Da die Enzymtests (Kapitel 2.4.7) in dieser Arbeit unter extremen Bedingungen durchgeführt wurden, ist davon auszugehen, dass Shikimisäure und Chinasäure auch nicht als schlechte Substrate akzeptiert werden. Die CbRAS ist eine reine CbRAS mit einer hohen Substratspezifität für die Akzeptorsubstrate p-Hydroxyphenyllactat und Dihydroxyphenyllactat. Von aufgereinigter RAS aus Coleus-Suspensionskulturen wurde von Petersen (1991) berichtet, dass neben den natürlichen Substraten pC-CoA und Caf-CoA auch Cin-CoA und möglicherweise auch Fer-CoA und Sin-CoA umgesetzt werden. Mit der heterolog exprimierten CbRAS konnte die Übertragung von Cin-CoA und Fer-CoA auf DL-pHPL sowie D-DHPL nachgewiesen werden. Ein Reaktionsprodukt aus Sin-CoA und DL-pHPL wurde allerdings nicht beobachtet. Fer-CoA wird im Vergeich zu den anderen CoA-aktivierten Säuren schlecht auf p-Hydroxyphenyl-lactat und Dihydroxyphenylp-Hydroxyphenyl-lactat übertragen. Im Standardenzymtest war keine oder nur sehr geringe Produktbildung zu beobachten. Da pHPL das beste Substrat der CbRAS ist, wurde die Übertragung von Sin-CoA nur in dieser Kombination getestet. Außerdem wurde

beschrieben, Phenyllactat wäre kein Substrat der nativen RAS. Das heterolog exprimierte Enzym jedoch setzt Cin-CoA, pC-CoA, Caf-CoA und Fer-CoA gut mit DL-Phenyllactat um.

Wie bei der CbHST wurde untersucht, ob die CbRAS neben Estern auch Amide knüpft.

Daher wurden dem Enzym Phenylalanin, Tyrosin und DOPA angeboten. Diese Aminosäuren unterscheiden sich von den natürlichen Substraten nur darin, dass die OH-Gruppe, an der enzymatisch angegriffen wird, durch eine NH₂-Gruppe ausgetauscht ist. Tatsächlich setzt die CbRAS Cin-CoA, pC-CoA und Caf-CoA, nicht aber Fer-CoA mit Phenylalanin, Tyrosin und DOPA um. Die Reaktionsprodukte Caf-Tyr und Cin-PA wurden hydrolysiert. Bei der Hydrolyse von Caf-Tyr konnten Kaffeesäure und Tyrosin nach gewiesen werden, bei der Hydrolyse von Cin-PA entstanden Zimtsäure und Phenylalanin. Weil Phenylalanin am aromatischen Ring keine Hydroxylgruppe besitzt, die verestert werden kann, ist die aliphatische NH₂-Gruppe der einzige Angriffspunkt für die Acylierung. Die Amidbildung wird auch für Tyrosin und DOPA angenommen.

Die CbRAS überträgt die CoA-aktivierten Säuren nicht nur auf Hydroxylgruppen, sondern besitzt auch N-Hydroxycinnamoyltransferase-Aktivität. Diese N-Acyltransferase-Aktivität ist allerdings sehr schwach. In den Standardenzymtests konnte keine Amidbildung gezeigt werden. Lediglich nach Inkubation über Nacht und unter Einsatz sehr großer Mengen an Enzym konnte diese Aktivität nachgewiesen werden.

Bemerkenswert ist die Stereoselektivität der CbRAS. Die Akzeptorsubstrate sind chirale Verbindungen. Das Chiralitätszentrum liegt am α-C-Atom der genannten Akzeptorsubstrate.

Es werden nur die folgenden Enantiomere umgesetzt: D-Phenyllactat, D-pHPL, D-DHPL, D-Phenylalanin, D-Tyrosin und D-DOPA. Die entsprechenden L-Enantiomere sind keine Substrate. Sie hemmen die Reaktion (Daten nicht gezeigt).

3.5.2.5. Untersuchung der Substratspezifität der CbRAS II

Die Übertragung von weiteren aliphatischen und aromatischen, für BAHD-Acyltransferasen typischen CoA-aktivierten Säuren (Acetyl-CoA, Malonyl-CoA, Benzoyl-CoA, Anthraniloyl-CoA), konnte nicht nachgewiesen werden. Demnach besitzt die CbRAS eine hohe Substratspezifität für (Hydroxy-)cinnamoyl-CoA-Derivate.

Auf der Akzeptorseite wurden verschiedene Substrate angeboten, die von anderen bekannten Hydroxycinnamoyltransferasen übertragen werden. Dazu zählen Anthranilsäure, 3-Hydroxyanthranilsäure, Tyramin, Tryptamin, Serotonin, Dopamin, L-DOPA und

2-Phenyl-ethylamin. pC-CoA wurde auf keinen der aufgeführten Akzeptoren übertragen. Die CbRAS setzt sehr spezifisch (Hydroxy-)phenylpropansäure-Derivate um.

3.5.2.6. Strukturelle Erfordernisse der Akzeptorsubstrate der CbRAS

Es wurde untersucht, ob die Carboxylgruppe des Akzeptorsubstrates essentiell für die Katalyse ist. Daher wurde ein Molekül ausgewählt, das dem natürlichen Substrat pHPL entspricht, dem allerdings die COOH-Gruppe fehlt: 2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol. Da kein enzymatischer Umsatz beobachtet wurde, ist anzunehmen, dass die Carboxylgroppe ein essentielles Strukturmerkmal darstellt. 3-(4-Hydroxyphenyl)propanol fungiert ebenfalls nicht als Akzeptorsubstrat.

In Kapitel 3.6.2 wird die Substratspezifität der CbRAS zusammengefasst. Die Strukturformeln der angebotenen Substrate sind dort abgebildet. Die HPLC-Chromato-gramme mit Positiv- und Negativkontrolle für Reaktionsprodukte ohne Referenzsubstanz befinden sich im Anhang.