Optimierung der Expression

Soll ein rekombinantes Protein wie die CbRAS in großen Mengen hergestellt werden, z.B. für die Kristallisation, muss das Zielprotein überexprimiert werden. Ist dies im Standardverfahren nicht der Fall, kann die Expression durch Variation verschiedener Parameter optimiert werden.

Alle Tests zur Optimierung der CbRAS-Expression werden zweimal in zeitlichem Abstand durchgeführt. Folgende Versuche werden durchgeführt:

1. Variation der Inkubationszeit nach Induktion I

Zunächst soll der optimale Erntezeitpunkt ermittelt werden. Dazu werden fünf Kolben mit CbRAS-Übernachtkultur angeimpft. Liegt die optische Dichte zwischen 0,7 bis 0,8 wird durch Zugabe von 1mM IPTG induziert. Eine Kultur wird direkt nach Induktion geerntet. Alle weiteren Kulturen werden bei 37 °C geschüttelt und nacheinander geerntet. Die Erntezeitpunkte sind 3 h, 4 h, 5 h und 6 h nach Induktion. Die Kontrollproben werden parallel geerntet, sind aber nicht induziert.

2. Variation der Inkubationstemperatur

Erniedrigung der Temperatur führt nicht nur zu einem verlangsamten Bakterienwachstum, sondern auch zu einer verlangsamten Bildung des Zielproteins. Dies kann zu einer Erhöhung des Anteils an gelöstem Protein führen.

Drei CbRAS-Bakterienkulturen werden bis zur gewünschten optischen Dichte bei 37 °C kultiviert. Nach Induktion mit 1mM IPTG wird eine Kultur standardmäßig bei 37 °C für 5 Stunden kultiviert. Die zweite Kultur wird nach Induktion bei 25 °C geschüttelt und nach 8 Stunden geerntet. Die dritte Kultur wird nach Induktion bei 4 °C inkubiert. Die Ernte erfolgt nach 96 h. Die mitgeführten Kontrollkulturen sind nicht induziert.

3. Variation der Inkubationszeit nach Induktion II

Es werden vier CbRAS-Hauptkulturen angeimpft. Alle Hauptkulturen wachsen bis zur optischen Dichte von 0,7 bis 0,8 im 37 °C-Schüttler. Nach Induktion durch Zugabe von 1mM IPTG wird bei 25 °C kultiviert. Es wird zu unterschiedlichen Erntezeitpunkten abzentrifugiert.

Der erste Kolben wird direkt nach Induktion geerntet, alle weiteren nach 6 h, 8 h und 10 h.

Die nicht induzierten Kontrollproben werden parallel geerntet.

4. Variation der IPTG-Konzentration

Das Expressionsstärke im pET-System kann über die zugegebene Menge an IPTG beeinflusst werden. Je höher die IPTG-Konzentration, desto höher ist die Expression des heterologen Proteins. Laut Herstellerangaben können niedrige Expressionslevel z.T. die Löslichkeit der gebildeten Proteine erhöhen. Es wird empfohlen, IPTG-Konzentrationen zwischen 25 µM und 1 mM zu testen.

Vier CbRAS-Hauptkulturen werden mit unterschiedlichen Mengen an IPTG induziert. Je ein Kolben wird auf eine Endkonzentration von 0,05 mM IPTG, 0,1 mM IPTG, 0,5 mM IPTG und 1 mM IPTG eingestellt. Nach Induktion wachsen die Kulturen nicht mehr bei 37 °C, sondern schütteln für 8 h bei 25 °C.

5. Variation der Inkubationszeit ohne Induktion

Es ist von Interesse, ob die Handhabung der Expression vereinfacht werden kann, indem auf die Wachstumsphase bei 37 °C verzichtet werden kann. Dazu werden drei CbRAS-Hauptkulturen sofort bei 25 °C geschüttelt und ohne Induktion für 17 h, 28 h und 42 h kultiviert.

6. Variation des Aufschlusspuffers

Detergenzien im Aufschlusspuffer können in einigen Fällen den Anteil an gelöstem Protein im Rohextrakt erhöhen.

Drei CbRAS-Kulturen werden bis zur Induktion mit 0,1 mM IPTG im Medium bei 37 °C inkubiert. Anschließend wachsen sie für 8 h bei 25 °C. Zur Herstellung des Proteinrohextrakts wird ein detergentienhaltiger Aufschlusspuffer verwendet. Der Aufschlusspuffer der Kontrollprobe ist 0,1 M KPi pH 7,0. Zur Herstellung eines dritten

Puffer geeignet ist. Wäre dies der Fall könnte der Herstellungsprozess der hochgereinigten CbRAS vereinfacht werden, da vor der His-Tag-Aufreinigung das Umpuffern entfallen würde.

Aufschlusspuffer mit Detergens:

292,2 mg NaCl 37,2 mg EDTA 200 mg Desoxycholat 1 ml Triton X 100

Ad 100 ml 50 mM Tris/HCl pH 7,5

7. Variation der Aufschlusszeit

Es wird untersucht, ob die Bakterien bei dem Aufschluss unter Standardbedingungen vollständig zerstört werden. Dazu wird insgesamt 10 min lang aufgeschlossen. Nach jeder Minute wurde eine Probe gezogen und deren Proteingehalt bestimmt. Es werden in einem Diagramm die Aufschlusszeit gegen den Proteingehalt aufgetragen.

8. Variation des Expressionszellstamms

Die Kombination aus Vektor und E. coli-Stamm beeinflusst das Expressionsstärke des Zielproteins. Um zu sehen, ob der Wechsel des Expressionsstamms zu einer verbesserten Überexpression führt, werden zwei verschiedene Übernachtkulturen angeimpft. Die erste stellt die Kontrolle dar und besteht aus E. coli BL21(DE3)pLysS mit der cDNA-Sequenz im Plasmid pET-15b. Bei der zweiten Übernachtkultur befindet sich der Vektor pET-15b inklusive CbRAS-cDNA im E. coli-Stamm BL21.

Von jeder Übernachtkultur werden 9 Hauptkulturen angelegt und den unterschiedlichen Wachstumsbedingungen ausgesetzt. Dabei wird neben der Wachstumstemperatur zusätzlich die zugegebene IPTG-Konzentration variiert.

Folgende Wachstumsbedingungen werden getestet:

 Wachstum bei 37 °C für 5 h

 Wachstum bei 25 °C für 8 h

 Wachstum bei 4 °C für 96 h

Für jede Wachstumsbedingung wird eine Kultur nicht induziert, eine mit 0,1 mM IPTG und eine mit 1mM IPTG versetzt.

9. Variation des Expressionsvektors

Führt die Optimierung der Kulturbedingungen allein nicht zum Erfolg, besteht im Austausch des Vektors eine weitere Möglichkeit, die Überexpression der CbRAS zu erreichen. Die Wahl des Vektors richtet sich nach den Eigenschaften des Proteins. Ist die Löslichkeit des Proteins schlecht, empfiehlt sich die Verwendung eines Vektorsystems, mit dessen Hilfe die CbRAS als gut lösliches Fusionsprotein hergestellt wird.

Für die Expression der CbRAS mit GST-Tag wird der pET-41a Vektor herangezogen (Umklonierung der CbRAS siehe Kapitel 2.3). Der Expressionszellstamm ist E. coli BL21(DE3)pLysS. Es werden 6 Hauptkulturen angeimpft. Als Kulturmedium dient LB Medium mit einem Zusatz von 30 µg/ml Kanamycin. Die Bakterien wachsen im Schüttler bei 37 °C bis zu einer optischen Dichte von 0,8. Zwei Kulturen wird kein IPTG zugesetzt, zwei Kulturen werden auf eine IPTG-Endkonzentration von 0,1 mM eingestellt und zwei Kulturen auf 1 mM IPTG. Anschließend werden die Bakterien bei 25 °C für 8 h oder bei 4 °C für 96 h kultiviert.

Die Verteilung der Kolben ist so, dass für jede Temperatur alle Induktionsbedingungen vertreten sind.