Enzymtests zur Bestimmung der Substratspezifität der CbHST und der CbRAS

In den Enzymtests zur Bestimmung der Substratspezifität sollen auch solche Substrate gefunden werden, die nicht sehr effektiv umgesetzt werden. Daher werden im Vergleich zu den Versuchen zur Bestimmung der pH- und Temperaturoptima sehr hohe Enzymkonzentrationen eingesetzt sowie die Inkubationszeit drastisch verlängert.

Bestimmung der Substratspezifität der CbHST:

Sämtliche Enzymtests zur Bestimmung der Substratspezifität werden mit der hundertfachen Menge an üblicherweise benötigem Enzym durchgeführt (siehe Kapitel 2.4.6). In jeden Ansatz werden 10 µl CbHST-Proteinlösung der Konzentration 170 µg/ml pipettiert. Die Reaktionszeit wird auf mindestens 30 min verlängert. Zunächst werden die Enzymtests auf RAS-, HST- und HQT-Aktivität unter den veränderten Versuchsbedingungen durchgeführt.

Angebotene Substrate sind die CoA-aktivierten Säuren pC-CoA und Caf-CoA in Kombination mit den Akzeptorsubstraten pHPL, DHPL, Shik und Chin. Es wird immer eine Negativkontrolle durchgeführt, bei der die Reaktion nicht durch Zugabe von Enzym gestartet, sondern satt dessen 10 µl Puffer zugesetzt wird. Auf diese Weise wird verhindert, dass bei der HPLC-Analyse falsch positive Produktpeaks identifiziert werden.

Zusätzlich zu diesen Substraten für Enzymtests auf RAS-, HST- und HQT-Aktivität werden weitere Substrate angeboten. Für die entstehenden Reaktionsprodukte stehen keine Referenzsubstanzen für die HPLC-Analyse zur Verfügung. Diese Tatsache erfordert ein gesondertes Vorgehen, um richtig positive und richtig negative Ergebnisse bei der HPLC-Analyse zu erhalten. Neben dem Standardenzymtest mit den entsprechenden Substraten (s.u.) und der Negativkontrolle ohne Enzym werden zwei weitere „Weglass-Tests“ durchgeführt. In dem einen fehlt das Akzeptorsubstrat, dem anderen „Weglass-Test“

fehlt die CoA-aktivierte Säure. Das fehlende Volumen wird jeweils mit dem Lösungsmittel ersetzt, in dem die fehlende Substanz gelöst ist.

Bei der HPLC-Analytik werden solche Peaks als potenziell positiv bewertet, die nur im Standardenzymtest auftreten, nicht aber in einem der „Weglass-Tests“. Um das potenziell positive Ergebnis zu verifizieren oder zu widerlegen, wird eine Zeitreihe gemessen. Wird der beobachtete Peak mit der Zeit größer und ist eine Sättigungskinetik erkennbar, wird der beobachtete Peak als wahrscheinlich positiv betrachtet. Wird der Peak mit der Zeit nicht größer, gilt er als falsch positiv. Er wird nicht als Produktpeak, sondern als Artefakt betrachtet.

Die wahrscheinlich positiven Peaks werden näher untersucht. Es besteht die Möglichkeit, die Masse (LC-MS) zu bestimmen, ein ¹H-NMR-Spektrum aufzunehmen, oder die Produktpeaks in ihre Ausgangssubstanzen zu hydrolysieren und den Akzeptor und die (jetzt nicht mehr CoA-aktivierte) Säure per HPLC zu analysieren. Gelingt dies, ist der Peak als positiv zu bewerten: Die CbHST setzt diese Substratkombination um.

Diese CoA-aktivierten Säuren werden der CbHST als Substrat angeboten. Das Akzeptorsubstrat ist immer Shikimat.

CoA-aktivierte Säure Akzeptorsubstrat erwartetes Produkt Cinnamoyl-CoA Shikimat Cin-Shik

Feruloyl-CoA Shikimat Fer-Shik Sinapoyl-CoA Shikimat Sin-Shik Benzoyl-CoA Shikimat Benz-Shik Anthraniloyl-CoA Shikimat Anth-Shik Malonyl-CoA Shikimat Mal-Shik Acetyl-CoA Shikimat Acet-Shik

Außerdem wird getestet, ob pC-CoA auf folgende Akzeptormoleküle übertragen wird.

Akzeptorsubstrat CoA-aktivierte Säure erwartetes Produkt

Anthranilsäure pC-CoA pC-Anth

3-Hydroxyanthranilsäure pC-CoA pC-3OH-Anth 2-Hydroxybenzoesäure pC-CoA pC-OHB 2,3-Dihydroxybenzoesäure pC-CoA pC-2,3DiOHB

3-Aminobenzoesäure pC-CoA pC-AB

Phenol pC-CoA pC-Ph

Tyramin pC-CoA pC-Tyra

Tryptamin pC-CoA pC-Trypt

Serotonin pC-CoA pC-Sero

Dopamin pC-CoA pC-Dop

L-DOPA pC-CoA pC-DOPA

2-Phenylethylamin pC-CoA pC-Pheneth

Sind Positivergebnisse vorhanden, schließen sich weitere Enzymtests an. Es wird untersucht, ob alle CoA-aktivierten Hydroxyzimtsäuren (pC-CoA, Caf-CoA, Cin-CoA, Fer-CoA und Sin-CoA) auf Shikimat, 3-Hydroxyanthranilsäure, 3-Hydroxybenzoesäure, 2,3-Dihydroxybenzoesäure und 3-Aminobenzoesäure übertragen werden.

Ist das Akzeptorsubstrat 3-Hydroxyanthranilsäure, 3-Hydroxybenzoesäure oder 2,3-Dihydroxybenzoesäure, beträgt die Inkubationszeit 120 min. Die RAS- und

HQT-Enzymtests werden 180 min lang inkubiert. Die Ansätze mit 3-Aminobenzoesäure reagieren über Nacht (16 h).

Bestimmung der Substratspezifität der CbRAS:

In den Enzymtests zur Bestimmung der Substratspezifität der CbRAS wird die CbRAS-Stammlösung in 1:2 verdünnter Form eingesetzt. Demnach werden in jeden Enzymtest 10 µl Enzym mit einer Proteinkonzentration von 420 µg/ml zugegeben. Die Inkubationszeit wird auf mindestens 30 min verlängert.

Zunächst werden wie bei der Bestimmung der Substratspezifität der CbHST die Enzymtests auf RAS-, HST- und HQT-Aktivität unter den oben angegebenen Bedingungen wiederholt.

Es wird untersucht, ob pC-CoA und Caf-CoA auf die Akzeptoren pHPL, DHPL, Shik und Chin übertragen werden. Negativkontrollen werden ebenso durchgeführt.

Anschließend werden auch der CbRAS weitere Substrate angeboten, deren Reaktionsprodukte nicht als Standardsubstanzen zur Verfügung stehen. Daher muss auch bei diesen Versuchen gesondert vorgegangen werden.

Diese CoA-aktivierten Säuren werden der CbRAS als Substrat angeboten. Das Akzeptorsubstrat ist immer pHPL.

CoA-aktivierte Säure Akzeptorsubstrat erwartetes Produkt

Cinnamoyl-CoA pHPL Cin-pHPL

Feruloyl-CoA pHPL Fer-pHPL

Sinapoyl-CoA pHPL Sin-pHPL

Benzoyl-CoA pHPL Benz-pHPL

Anthraniloyl-CoA pHPL Anth-pHPL

Malonyl-CoA pHPL Mal-pHPL

Acetyl-CoA pHPL Acet-pHPL

Außerdem wird getestet, ob pC-CoA auf folgende Akzeptormoleküle übertragen wird:

Akzeptorsubstrat CoA-aktivierte Säure erwartetes Produkt

Anthranilsäure pC-CoA pC-Anth

3-Hydroxyanthranilsäure pC-CoA pC-3OH-Anth

DL-Phenyllactat pC-CoA pC-PL

DL-Phenylalanin pC-CoA pC-PA

DL-Tyrosin pC-CoA pC-Tyr

DL-DOPA pC-CoA pC-DOPA

Tyramin pC-CoA pC-Tyra

Tryptamin pC-CoA pC-Trypt

Serotonin pC-CoA pC-Sero

Dopamin pC-CoA pC-Dop

L-DOPA pC-CoA pC-DOPA

2-Phenylethylamin pC-CoA pC-Pheneth

2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol pC-CoA pC-HPE 3-(4-Hydroxyphenyl)propanol pC-CoA pC-HPP

In weiteren Tests wird die Übertragung von Caf-CoA, Cin-CoA und Fer-CoA auf pHPL, DHPL, Phenyllactat, Phenylalanin, Tyrosin und DOPA analysiert. L-PL, L-DOPA, L-Tyr und L-PA werden in Kombination mit pC-CoA getestet.

Bei einigen Enzymtests wird die Inkubationszeit noch weiter verlängert. Cin-CoA und Fer-CoA reagierten mit DL-DOPA für 120 min. Enzymtests mit Tyrosin inkubieren 360 min lang.

Ist das Akzeptorsubstrat Phenylalanin, so wird über Nacht inkubiert. Ebenfalls über Nacht inkubieren die Substratkombinationen aus Sin-CoA mit pHPL, Cin-CoA / Fer-CoA mit Phenyllactat, sowie Caf-CoA mit L-DOPA.