2. Material und Methoden
2.1. Versuche zur cDNA-Klonierung einer HST aus Coleus blumei
2.1.13. Sequenzvergleich mit der NCBI-Datenbank
Liegt das Sequenzierungsergebnis vor, kann die Sequenz einer Datenbankrecherche (http://blast.NCBI.nlm.nih.gov/Blast.cgi) unterzogen werden. Dabei wird die Sequenz mit schon bekannten Sequenzen verglichen. Besteht eine hohe Ähnlichkeit zu anderen BAHD-Acyltransferasen, handelt es sich bei dem Insert wahrscheinlich um das Mittelstück einer BAHD-Acyltransferase.
2.1.14. Isolierung der 5´- und 3´-Enden mit GeneRacer™ Kit
Das GeneRacer™ Kit ermöglicht die Isolierung der 5´- und 3´-Enden von kurzen Transkripten. Es basiert auf der sogenannten RACE-PCR (rapid amplification of cDNA-ends with polymerase chain reaction). Dazu wird die 5´-Cap-Struktur der mRNA entfernt und ein RNA-Oligonukleotid mit Hilfe einer T4-RNA-Ligase angeheftet. An den Poly-A-Schwanz der mRNA wird über den Oligo-dT-Primer bei der Reversen Transkription ebenfalls eine DNA-Sequenz angeheftet. Die nun erhaltene RACE-fertige cDNA besitzt am 5´- und am 3´-Ende bekannte Sequenzen, die als Primerbinderegionen bei der Amplifikation der cDNA-Enden dienen.
Das Protokoll der Firma Invitrogen sieht folgendes Vorgehen vor:
1. Gesamt-RNA aus Coleus blumei wird mit dem Enzym CIP (calf intestinal phosphatase) behandelt. Dieses Enzym entfernt 5´-Phosphatreste von Nukleinsäuren. Intakte mRNA mit 5´-Cap-Struktur wird nicht von CIP dephosphoryliert.
In einem sterilen 1,5 ml Eppendorfgefäß wird auf Eis gemischt, gevortext und herunterzentrifugiert:
X µl Gesamt RNA (1-5 µg) 1 µl 10 CIP-Puffer
1 µl RNaseOut™ (40 U/µl) 1 µl CIP (10 U/µl)
ad 10 µl DEPC Wasser
Dieser Reaktionsansatz wird für eine Stunde bei 50 °C inkubiert. Anschließend wird der Ansatz nach kurzer Zentrifugation auf Eis gestellt.
Es folgt die Fällung der RNA:
90 µl DEPC Wasser 100 µl Phenol-Chloroform
werden addiert und für 30 Sekunden gut gevortext. Es schließt sich eine fünfminütige Zentrifugation mit 16.000 g bei Raumtemperatur an. Die obere, wässrige Phase wird in ein neues Eppendorfgefäß überführt.
Zu diesem Überstand werden 2 µl Muschelglykogen (10 mg/ml) 10 µl 3 M Natriumacetat pH 5,2
addiert und gut gemischt. Jetzt kommen noch 220 µl 95% Ethanol
hinzu. Es wird geschüttelt und die Mischung 10 Minuten auf Eis gestellt.
Um die RNA zu sedimentieren, zentrifugiert man 20 Minuten lang bei 4 °C und 16000 g. Der Überstand wird vorsichtig mit einer Pipette entfernt, ohne das RNA-Pellet zu entfernen. Die RNA wird mit 500 µl 70% Ethanol gewaschen. Nach mehrmaligem Umdrehen und schütteln folgt eine Zentrifugation für 2 Minuten bei 16000 g bei 4 °C. Der Ethanol wird vorsichtig abgehoben und das RNA-Pellet bei Raumtemperatur 2 Minuten getrocknet. Zum Schluss wird die RNA in 7 µl DEPC Wasser rückgelöst.
2. Die dephosphorylierte RNA wird mit TAP (tabacco acid phosphatase) behandelt, um die 5´-Cap-Struktur von intakter Volllängen-mRNA zu entfernen. Durch dieses Vorgehen entstehen 5´-Phosphatenden, die für die Ligation des RNA-Oligonukleotids essentiell sind.
Dazu wird dieser Reaktionsansatz in einem sterilen 1,5 ml Eppendorfgefäß auf Eis zusammenpipettiert:
7 µl dephosphorylierte RNA 1 µl 10 TAP-Puffer
1 µl RnaseOut™ (40 U/µl) 1 µl TAP (0,5 U/µl)
Dieser Ansatz wird gemischt und herunterzentrifugiert, und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert.
Nach der Inkubation wird wieder herunterzentrifugiert und die Reaktion auf Eis platziert.
Zur Fällung der RNA wird wie oben beschrieben verfahren.
3. Es folgt die Ligation des RNA-Oligonukleotids GeneRacer™-RNA-Oligo an das 5´-Ende der mRNA.
Zum lyophilisierten GeneRacer™ RNA Oligo mit 44 Basen
5´-CGA CUG GAG CAG CAC GAG GAC ACU GAC AUG GAC UGA AGG AGU AGA AA-3´
werden 7 µl der gefällten RNA zugegeben.
Es wird durch Pipettieren gut gemischt und herunterzentrifugiert.
Nach fünfminütiger Inkubation bei 65 °C, wird für 2 Minuten auf Eis abgekühlt.
Nun werden die folgenden Reagenzien mit der RNA vermischt 1 µl 10 Ligase Puffer
1 µl 10 mM ATP
1 µl RNaseOut™ (40 U/µl) 1 µl T4 RNA Ligase (5 U/µl)
und eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Es wird herunterzentrifugiert und auf Eis abgekühlt.
Zur Fällung der RNA wird wie oben beschrieben verfahren.
4. Nach der Transkription erhält man RACE-fertige cDNA mit bekannten Primerbereichen an den 5´- und 3´-Enden. Der GeneRacer™-Oligo-dT Primer bindet an den Poly-A-Schwanz und ist an seinem 3´-Ende um eine bekannte Sequenz von 36 Basen verländert.
Zur gefällten RNA wird
1 µl GeneRacer™ Oligo-dT-Primer 1 µl dNTP Mix
1 µl steriles destilliertes Wasser
addiert und alles für 5 Minuten auf 65 °C erhitzt. Die Reaktion wird für eine Minute auf Eis abgekühlt und herunterzentrifugiert.
Der GeneRacer™-Oligo-dT-Primer ist 60 Basen lang und hat folgende Sequenz:
5´-GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC GGC ATG ACA GTG (T)24-3´
Nun werden diese Reagenzien hinzugefügt:
4 µl 5 First Strand Puffer 1 µl 0,1 M DTT
1 µl RNaseOut™ (40 U/µl)
1 µl SuperScript™ III RT (200 U/µl)
Man mischt durch Auf- und ABasenpaareipettieren. Es wird herunterzentrifugiert und 60 Minuten bei 50 °C inkubiert. Die Reverse Transkriptase wird durch Erhitzen auf 70 °C für 5 Minuten inaktiviert. Nach Abkühlen auf Eis für 2 Minuten wird bei 16000 g zentrifugiert.
Zum Verdauen des RNA-Stranges wird mit 1 µl RNase H (2 U)
20 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die cDNA ist nun einsatzbereit für die PCR.
5. Um das 5´-Ende des gewünschten Transkripts zu erhalten, setzt man bei der PCR den GeneRacer™-5´-Primer und einen transkriptspezifischen reverse Primer ein. Der GeneRacer™-5´-Primer ist komplementär zum GeneRacer™-RNA-Oligo. Wird kein PCR-Produkt erhalten, ist eine entsprechende nested PCR durchzuführen.
Für die erste 5´-RACE-PCR und für die 5´-nested-PCR wurden folgende genspezifischen Primer verwendet:
HCT-Cb-3´ mit 23 Basen und einer errechneten Schmelztemperatur von 67,8 °C:
5´-CAT GGC TGG AGG GGG CTG GTA CT-3´
HCT-Cb-3´n mit 23 Basen und einer errechneten Schmelztemperatur von 67,8 °C:
5´-CGT CGG CTG CGT GGT GCT GCA TT-3´
Als Ankerprimer dient der GeneRacer™ 5´-Primer mit 23 Basen und einer angegebenen Schmelztemperatur von 74 °C:
5´-CGA CTG GAG CAC GAG GAC ACT GA-3´
Der PCR-Ansatz für die erste 5´-RACE PCR hat folgende Zusammensetzung:
5 µl 10 High Fidelity PCR Puffer 3 µl 25 mM MgCl2
1 µl 10 mM dNTP-Mix
1 µl Gene Racer cDNA Coleus 1:5 verdünnt 3 µl 10 pmol/µl Primer HCT-Cb-3´
3 µl 10 pmol/µl Gene Racer 5´Primer 0,5 µl (5 U/µl) High Fidelity Taq-Polymerase ad 50 µl nukleasefreies Wasser
Das Programm für die PCR lautet wie folgt:
Die 5´-nested PCR wird analog zur 5´-RACE-PCR durchgeführt. Als Template wird 1µl des 5´-RACE-PCR Ansatzes (49 °C) und der Primer HCT-Cb-3n´ in Kombination mit dem Gene Racer-5´-Primer eingesetzt.
6. Um das 3´-Ende des gewünschten Transkripts zu erhalten, setzt man bei der PCR den GeneRacer™-3´-Primer und einen transkriptspezifischen forward Primer ein. Der GeneRacer™-3-´Primer bindet an den GeneRacer™-Oligo-dT-Primer. Wird kein PCR-Produkt erhalten, wird eine entsprechende nested PCR durchgeführt.
Für die erste 3´-RACE PCR und für die 3´-nested PCR stehen diese Primer zur Verfügung:
HCT-Cb-5´ mit 29 Basen und einer errechneten Schmelztemperatur von 69,5 °C:
5´-CCA CCA GGC TAC TTC GGC AAC GTG ATC TT-3´
HCT-Cb-5´n mit 28 Basen und einer errechneten Schmelztemperatur von 66,6 °C:
5´-CGA CTA CTT GAG GTC AGC TCT GGA TTT C-3´
Der Ankerprimer ist bei beiden PCR-Ansätzen der GeneRacer™ 3´-Primer mit 25 Basen und einer angegebenen Schmelztemperatur von 76 °C:
5´-GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC G-3´
Die Zusammensetzung der 3´-RACE-PCR entspricht der 5´-RACE-PCR. Die verwendeten Primer sind HCT-Cb-3´ und GeneRacerTM-3´-Primer. Die 3´-RACE-PCR wird wie die Temperatur Zeit Zyklen
95 °C 5 min
49 °C/55 °C/60 °C 45 s 1
72 °C 3 min
95 °C 30 s
49 °C/55 °C/60 °C 45 s 38
72 °C 1,5 min
72 °C 10 min 1
5´-RACE-PCR, aber bei vier verschiedenen Annealingtemperaturen (45 °C/50 °C/55 °C/60 °C) durchgeführt.
Im Ansatz für die 3´-nested-PCR sind als Primer HCT-Cb-3´n in Kombination mit dem Gene-Racer-3´-nested Primer und 1 µl des 3´-RACE-PCR Ansatzes zu verwenden. Das PCR-Programm wird identisch wiederholt.
7. Die PCR-Produkte werden in einen Klonierungsvektor ligiert, um sie weiter zu untersuchen.
Dazu werden die PCR-Banden aus dem Agarosegel herausgeschnitten, mit dem Nucleo Spin-Extract® II Kit aufgereinigt und in den pGEM®-T-Vektor ligiert. Als Klonierungsstamm wird E. coli verwendet. Mittels Plasmidpräparation wird auf positive Klone hin untersucht.
Positive Klone werden als Bakteriendauerkultur gelagert. Jeweils eine Minipräparation wird zum Sequenzieren geschickt. Entspricht das 5´- bzw. das 3´-Ende der Sequenz des Mittelstücks aus Coleus blumei, kann die Volllängensequenz der HST aus Coleus blumei amplifiziert werden.