Aufreinigung des CbRAS-Proteins aus inclusion bodies

Entstehen fehlerhaft oder unvollständig gefaltete Proteine als unlösliche Aggregate im Cytoplasma von Zellen, so spricht man von Einschlusskörperchen oder inclusion bodies.

Inclusion bodies von heterolog exprimierten Proteinen werden vor allem dann gebildet, wenn das Protein schwer löslich ist und exzessiv synthetisiert wird. Es besteht die Möglichkeit, das Protein dieser Einschlusskörperchen zu lösen, zurückzufalten und die Enzyme in aktiver

leicht und in großer Menge hergestellt werden, zum anderen wird die Aufreinigung erleichtert, da sie sehr sauber sind. Je nach Zielprotein und Expressionsbedingung können die gewaschenen inclusion bodies einen Reinheitsgrad von über 90% aufweisen.

Das Protein Refolding Kit der Firma Novagen wird verwendet, um die CbRAS aus inclusion bodies zu gewinnen. Dabei werden die unlöslichen Einschlusskörperchen zunächst durch

Zentrifugation isoliert und in einem alkalischen CAPS-Puffer in Kombination mit N-Lauroylsarcosin in Lösung gebracht, gefolgt von einer Dialyse unter milden

denaturierenden Bedingungen. Hierbei wird das Protein korrekt zurückgefaltet. Zum Schluss kann in einen Puffer der Wahl umgepuffert werden. Die optimalen Bedingungen müssen für jedes Protein empirisch ermittelt werden.

Die Anleitung des Herstellers zur Gewinnung der inclusion bodies sieht folgendes Vorgehen vor:

Zunächst wird das entsprechende Enzym in einer Bakterienkultur heterolog exprimiert. In diesem Fall werden 3 l Hauptkultur (CbRAS-VL in pET-15b in E. coli BL21(DE3)pLysS) angeimpft und sofort in den 25 °C-Schüttler gestellt. Die Bakterien mit den CbRAS inclusion bodies werden nach 24 Stunden als 12 Bakterienpellets durch Zentrifugation geerntet.

Zur Gewinnung der CbRAS aus inclusion bodies wird ein Bakterienpellet aufgearbeitet. Die Bakterien werden in 25 ml 1x IB Wash Buffer resuspendiert und per Ultraschall (0,3 cycles, 100%, 10x 1 min) aufgeschlossen. Auf jede Minute Aufschluss folgt eine Minute Kühlen auf Eis. Nun werden die inclusion bodies durch Zentrifugation mit 10000 g für 10 Minuten isoliert.

Der Überstand mit löslichen Proteinen und löslicher CbRAS wird verworfen. Um lose assoziierte Verunreinigungen zu entfernen, wird das Sediment erneut in 25 ml 1x IB Wash Buffer resuspendiert und das Nassgewicht nach wiederholter Zentrifugation bestimmt. Um bei einer Masse von 520 mg eine Endkonzentration zwischen 1 und 4 mg/ml zu erreichen, werden 35 ml 1x IB Solubilization Buffer, der mit 0,35 ml N-Laurylsarcosinlösung und 35 µl 1 M DTT versetzt ist, zugegeben. Die inclusion bodies werden vorsichtig resuspendiert und bei Raumtemperatur für 25 Minuten auf dem Magnetrührer gerührt. Durch Zentrifugation mit 10000 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur werden die nun gelösten CbRAS-Proteine von Zelltrümmern befreit. Der Überstand wird vorsichtig in einen Dialysierschlauch gefüllt und gegen 1750 ml 1x Dialysis Buffer mit 175 µl DTT bei 4 °C dialysiert. Nach 3 Stunden wird der Dialysis Buffer erneuert und über Nacht dialysiert. Es wird eine Probe genommen, um auf

RAS-Aktivität zu testen, die Proteinkonzentration zu bestimmen und die Reinheit der inclusion bodies mittels SDS-PAGE zu analysieren.

Um aktive CbRAS mit möglichst hohem Reinheitsgrad zu gewinnen, wird das Verfahren durch Variation der Aufschlussbedingungen und der Anzahl der Waschschritte optimiert.

Zum einen wird die Anzahl der Waschschritte von zwei auf vier erhöht. Zum anderen werden aus einem Bakterienpellet zwei oder drei Rohextrakte hergestellt: Nach zehnminütigem Aufschluss wird zentrifugiert, der Überstand wird verworfen. Das verbleibende Bakterienpellet mit den inclusion bodies wird erneut für zehn Minuten aufgeschlossen. Es schließt sich der Zentrifugationsschritt an. Dieser Vorgang kann ein weiteres Mal wiederholt werden, bevor das Sediment in 1x IB Wash Buffer resuspendiert und wie oben beschrieben fortgefahren wird.

10x IB Wash Buffer: 1x IB Solubilization Buffer: 50x Dialysis Buffer

200 mM Tris/HCl pH 7,5 500 mM CAPS pH 11,0 1 M Tris/HCl pH 8,5 100 mM EDTA

10% Triton-100

2.2.14. Abspaltung des His-Tags mit dem Thrombin CleanCleave™-Kit

Können keine Kristallisationsbedingungen für ein heterolog exprimiertes Protein gefunden werden, so kann die Abspaltung der Fusions-Tags eine Möglichkeit bieten, um die Kristallisation zu erreichen. Es ist außerdem von Interesse, welchen Einfluss der His-Tag auf die enzymkinetischen Parameter sowie auf das Temperatur- sowie das pH-Optimum ausübt.

Zwischen dem His-Tag und der Aminosäuresequenz der CbRAS befindet sich eine Schnittstelle für die Serinprotease Thrombin.

Es wird das Thrombin CleanCleave™-Kit der Firma Sigma verwendet. Hierbei ist das Thrombin durch eine Agarosematrix immobilisiert und kann nach der Abspaltung problemlos von der CbRAS-Proteinlösung entfernt werden.

Probenvorbereitung:

Für die Abspaltung des 6xHis-Tags wird lösliche CbRAS aus dem Proteinrohextrakt gewonnen und standardmäßig über His-Tag-Affinitätschromatographie gereinigt. Die Elutionsfraktion wird über Dialyse in 1x Cleavage Buffer umgepuffert und anschließend mit Hilfe von Spectra Gel™ aufkonzentriert bis eine Proteinkonzentration von 1,7 mg/ml erreicht ist.

Vorbereitung der Thrombin-Agarose-Matrix:

100 µl der resuspendierten Thrombin-Agarose-Matrix werden in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt. Das Säulenmaterial wird mit 1x Cleavage Buffer äquilibriert. Dazu wird die Suspension bei 500 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Sediment wird in 500 µl 1 Cleavage Buffer gewaschen und der Überstand nach Zentrifugation entfernt. Dieser Waschschritt wird wiederholt.

Proteolysereaktion:

Zunächst werden die 50 µl äquilibrierte Thrombin-Agarose in 100 µl 10x Cleavage Buffer resuspendiert. Es werden 600 µl der vorbereiteten Enzymlösung sowie 250 µl destilliertes

Wasser addiert. In einer zweiten Proteolysereaktion wird auf die Zugabe der 100 µl 10x Cleavage Buffer verzichtet. Zur Thrombin-Agarose werden 600 µl Enzymlösung und

350 µl 1x Cleavage Buffer gegeben. Die Reaktionen schütteln bei Raumtemperatur (21 °C).

Nach 1, 2, 4, 6 und 24 Stunden werden Proben gezogen, um die Inkubationszeit zu ermitteln, die bei diesen Reaktionsbedingungen benötigt wird. Die Proben werden mittels SDS-PAGE analysiert.

Zur Optimierung der Proteolysereaktion wird ein Versuch durchgeführt, bei dem auf den 10x Cleavage Buffer verzichtet und 10% DMSO addiert wird. Die Reaktionsansätze schütteln bei 25 °C. Die Reaktion wird nach 72 Stunden beendet. Es werden Proben nach 2, 7,5 und 72 Stunden genommen.

Gewinnung der His-Tag-freien CbRAS:

Sowohl die gespaltene als auch die ungespaltene CbRAS befindet sich im Überstand. Durch Zentrifugation für 5 min bei 500 g wird die Thrombin-Agarosematrix von der Proteinlösung entfernt.

10x Cleavage Buffer

500 mM Tris/HCl pH 8,0 100 mM CaCl2

Um die gespaltene CbRAS von der ungespaltenen zu reinigen, wird eine Tag-Affinitätschromatographie angeschlossen. Nur CbRAS mit Tag und der freigesetzte His-Tag binden an das Säulenmaterial. Der Durchlauf, der die gespaltene CbRAS enthält, wird gewonnen und in 20 mM Tris/HCl pH 7,5 mit 0,02% Natriumazid umgepuffert.

Zur Feinreinigung der CbRAS kann eine Affinitätschromatographie an TSK AF-Blue angeschlossen werden. Verwendet wird das optimierte Programm, das im Ergebnisteil (Kapitel 3.3.9) beschrieben ist.