Untersuchung einer gegenseitigen Modulation von LPS und HMGB1

Tabelle 70: Anzahl der für die kombinierten Messprotokolle der „Ca²⁺-Imaging“ Versuche verwendeten Zellkulturen und der Präparationen, aus denen diese Kulturen stammten

Messprotokoll Anzahl Zellkulturen Anzahl Präparationen

LPS  HMGB1  LPS + HMGB1 14 8

HMGB1  LPS  LPS + HMGB1 15 9

Für die Untersuchung eines modulatorischen Effektes von LPS auf die HMGB1-induzierte Zellreaktion (Abbildung 34, A(I)) sowie von HMGB1 auf die LPS-bedingte Zellreaktion (Abbildung 34, A(II)), wurden zwei unterschiedliche Messprotokolle verwendet. Deren Ergebnisse sind in Abbildung 34 gegenübergestellt.

Bei den Dosis-Wirkungs-Untersuchungen lag lediglich eine geringe HMGB1-Responsivität vor. Es reagierten ausschließlich Neurone auf die Bolusapplikation von HMGB1 und bei einer Konzentration von 1 µg/ml waren lediglich 0,83 % der Neurone responsiv (Abbildung 32). Die zelltypunabhängige Berechnung ergab für 0,43 % der untersuchten Zellen eine Responsivität gegenüber HMGB1 (1 µg/ml). Bei dem hier angewendeten kombinierten Messprotokoll führte eine vorherige Bolusapplikation von LPS zu einem Anstieg des prozentualen Anteils responsiver Zellen. Es reagierten 3,4 % der Neurone und 3 % der Astrozyten responsiv auf die HMGB1-Applikation (Abbildung 34, A(I)). Dadurch ergab sich bezogen auf alle untersuchten Zellen und Zelltypen eine Responsivität von 3,03 % gegenüber HMGB1 (1 µg/ml). Verglichen mit dem prozentualen Anteil HMGB1-responsiver Zellen (1 µg/ml) der Dosis-Wirkungs-Untersuchungen (0,43 % der untersuchten Zellen responsiv) (Abbildung 32) stieg der prozentuale Anteil responsiver Zellen durch die vorherige Applikation von LPS um das 7,05-fache. Verglichen mit dem hier angewendeten Protokoll zur Untersuchung der Beeinflussung von HMGB1 auf die LPS-bedingte Reaktion, bei dem HMGB1 als erster, unbeeinflusster Stimulus eingesetzt wurde (Abbildung 34, A(II)), um das 9,2-fache (0,33 % der Zellen reagierten responsiv auf HMGB1). Außerdem ist besonders hervorzuheben, dass nach vorangegangener LPS-Applikation nun auch Astrozyten auf eine Bolusapplikation von HMGB1 (1 µg/ml) reagierten.

In Abbildung 34 C(I) werden die responsiven Zellen nach ihrem Reaktionsmuster aufgegliedert dargestellt. Unter den HMGB1-responsiven Zellen reagierten drei Zellen nur auf die Bolusapplikation von HMGB1. Eine Zelle reagierte auf alle drei Bolusapplikationen, nämlich LPS, HMGB1 sowie auf die kombinierte Applikation von LPS und HMGB1. Fünf Zellen reagierten sowohl auf LPS als auch auf HMGB1 und eine Zelle zeigte eine Reaktion auf HMGB1 sowie die kombinierte Bolusapplikation. Zusätzliche lag bei fünf Zellen ausschließlich eine Reaktion auf die kombinierte Applikation von LPS und HMGB1 vor. Der

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prozentuale Anteil LPS-responsiver Zellen an den insgesamt untersuchten Zellen (5,5 %) entsprach bei diesem Versuchsprotokoll, bei dem die Applikation von LPS die erste Stimulation darstellte und damit unbeeinflusst war, weitgehend dem prozentualen Anteil der Zellen, die bei den Dosis-Wirkungs-Versuchen mit einer Erhöhung der Ratio auf die Bolusapplikation von LPS (1 µg/ml) reagierten (4,5 %).

Bei dem zweiten Messprotokoll zur Untersuchung einer gegenseitigen Modulation wurde eine HMGB1-Applikation vor einer LPS-Applikation vorgenommen. Dabei reagierte nur ein Neuron auf die Applikation von HMGB1. Das entspricht 0,7 % der gemessenen Neurone und 0,33 % der insgesamt gemessenen Zellen. Somit ergaben sich für die unbeeinflusste Responsivität auf HMGB1 in diesem Messprotokoll annähernd gleiche Ergebnisse wie für die ermittelte Responsivität bei den Dosis-Wirkungs-Untersuchungen. Jedoch kam es durch die vorherige Applikation von HMGB1 zu einer starken Reduktion des prozentualen Anteils LPS-responsiver Zellen. Es reagierten lediglich noch 0,68 % der Neurone und 0,8 % der Astrozyten auf eine Bolusapplikation von LPS einer Konzentration von 1 µg/ml. Insgesamt zeigten 0,67 % der untersuchten Zellen eine Reaktion auf die Applikation von LPS. Der prozentuale Anteil der LPS-responsiven Zellen wurde demnach durch die vorherige Stimulation mit HMGB1 6,7-fach gegenüber dem prozentualen Anteil responsiver Zellen der Dosis-Wirkungs-Untersuchung (1 µg/ml) reduziert. Gegenüber der unbeeinflussten Stimulation mit LPS im Rahmen dieser kombinierten Messprotokolle (Abbildung 34, A(I)) konnte sogar eine 8,1-fache Reduktion des prozentualen Anteils der responsiven Zellen nachgewiesen werden. In der differenzierten Darstellung der Reaktionsmuster responsiver Zellen (Abbildung 34, C(II)) ist zu erkennen, dass die HMGB1-responsive Zelle sowohl auf HMGB1 als auch auf LPS reagierte. Eine weitere Zelle reagierte ausschließlich auf LPS.

Zusätzlich reagierten zwei Zellen auf die kombinierte Applikation von LPS und HMGB1. Auch der prozentuale Anteil dieser auf die kombinierte Applikation von LPS und HMGB1 reagierenden Zellen wurde durch die Anwendung der Bolusapplikation von HMGB1 als unbeeinflusstem Stimulus deutlich gegenüber der Anwendung von LPS als unbeeinflusstem Stimulus reduziert.

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Abbildung 34: Darstellung der Ergebnisse zur Untersuchung einer gegenseitigen Beeinflussung von LPS und HMGB1 mit Hilfe der „Ca²⁺-Imaging“ Technik

Die verwendeten Messprotokolle werden in A(I) und A(II) dargestellt. Die Bolusapplikation von PBS diente zum Ausschluss mechanosensitiver Zellen und die Superfusion mit KCl stellte einen Vitalitätstest für Neurone dar, der der Vitalitätseinschätzung der gesamten Kultur diente. In A(I) wurde LPS als erster, unbeeinflusster Stimulus verwendet; in A(II) war es HMGB1. In B(I) bzw. B(II) wird der prozentuale Anteil der für den entsprechenden Stimulus responsiven Zellen weiß dargestellt. Die absolute Anzahl responsiver Zellen wird durch „n“ angegeben. „N“ zeigt die Gesamtzahl der gemessenen Zellen. Die Anzahl der untersuchten Zellkulturen und Präparationen ist der Tabelle 70 zu entnehmen. Durch die vorherige Applikation von LPS war der prozentuale Anteil HMGB1-responsiver Zellen deutlich höher (B(I)) als ohne vorherige LPS-Stimulation (B(II)). Hingegen wurde die Responsivität gegenüber LPS deutlich durch die vorherige Applikation von HMGB1 reduziert (B(II)). In C(I) und C(II) wird das Reaktionsmuster der responsiven Zellen dargestellt. Einige der responsiven Zellen reagierten auf mehrere der verwendeten Applikationen mit einem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration.

6 Zusammenfassung der wichtigsten Ergebnisse zur Charakterisierung der Bedeutung von HMGB1 während einer Sepsis

 Ratten zeigten ein über 24 Stunden anhaltendes LPS-induziertes Fieber. Zu diesem Zeitpunkt erreichtenen die Plasmakonzentrationen von IL-6 und TNFα bereits wieder basale Werte

 LPS führte zu einer Erhöhung der HMGB1-Plasmakonzentration über 24 Stunden.

 Die relative Expression von HMGB1, RAGE und TLR4 wurde im Hypothalamus sowie in der Milz marginal und in der Leber signifikant durch die i.p. Injektion von LPS reduziert.

 24 Stunden nach LPS-Injektion lag im Gehirn in der AP und dem MnPO eine perinukleäre Translokation von HMGB1 vor. In Kontrollen war hingegen nukleäre HMGB1-Immunreaktivität nachweisbar.

 In vitro führte LPS ebenfalls zu einer signifikanten Reduktion intranukleärer HMGB1-Signale in Primärkulturen der AP.

 Eine Stimulation mit HMGB1 bewirkte in vitro die Aktivierung von NFκB (vor allem in Astrozyten), nicht jedoch von NF-IL6.

 Die Stimulation mit HMGB1 führte in vitro zu einem signifikanten Anstieg der IL-6-Konzentration in Überständen der Primärkulturen. Die TNFα-IL-6-Konzentrationen wurden nicht signifikant erhöht. In Mikrogliazellen war eine HMGB1-induzierte Immunreaktivität von IL-1β nachweisbar.

 Zellen der APreagierten mit einer höheren Responsivität auf die Applikation von LPS unterschiedlicher Konzentrationen als auf die Applikation von HMGB1 unterschiedlicher Konzentrationen.

o Nur wenige Neurone reagierten responsiv auf eine Applikation von HMGB1.

o Eine vorherige Applikation von LPS erhöhte den prozentualen Anteil HMGB1-responsiver Zellen deutlich.

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o Eine vorherige Applikation von HMGB1 führte zu einer deutlichen Reduktion des prozentualen Anteils LPS-responsiver Zellen.

IVB Untersuchung der Freisetzung von pro- und

anti-inflammatorischen Lipidmediatoren aus Primärkulturen der AP

Die Metaboliten der Arachidonsäure („arachidonic acid“, AA), der Docosahexaensäure („docosahexaenoic acid“, DHA) und der Eicosapentaensäure („eicosapentaenoid acid“, EPA) sind für die Induktion und die Beendigung der Inflammation von großer Bedeutung und können auch im Gehirn nachgewiesen werden (siehe Kapitel IA2.1.2.3 und ID3).

Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Flüssigchromatographie mit Massenspektrometriekopplung (“liquid chromatography-mass spectrometry“, LC-MS/MS) eine geeignete Methode zur Quantifizierung der Lipide sowie der Lipidmediatoren in Überständen von Primärkulturen der AP darstellt und welchen modulatorischen Einfluss LPS und HMGB1 auf ihre Synthese haben.

Die Primärkulturen der AP wurden mit LPS (10 µg/ml) oder HMGB1 (10 µg/ml) stimuliert oder mit PBS als Kontrolle inkubiert. Es lagen zwei Behandlungsgruppen vor. In einer Gruppe erhielten die Kulturen nach 46 Stunden einen Zusatz von AA, DHA und EPA (jeweils 5 µg/ml), in der anderen nicht (siehe Kapitel IIID1.2.1). Die Überstände wurden nach 48 Stunden abgenommen und in Zusammenarbeit mit Dr. Sabine Schulz einer Messung mittels LC-MS/MS unterzogen (siehe Abbildung 20 und Kapitel IIIE4.2). Zur Kontrolle der biologischen Bedeutung von gemessenen Konzentrationen wurden zusätzliche Blindproben ohne Zellen angefertigt. Dafür wurden die Zellkulturgefäße ebenso behandelt und stimuliert wie die zu untersuchenden Primärkulturen, enthielten jedoch keine Zellen. Bei der Darstellung der Ergebnisse wurden die Konzentrationen der unterschiedlich behandelten Blindproben zusammengefasst. Die schwarz-weiß gestreiften und mit dem Begriff „ohne Zellen“ markierten Balken setzen sich demnach aus den Konzentrationen einer mit LPS, einer mit HMGB1 und einer mit PBS inkubierten Kultur zusammen und sind ebenfalls als

„mean of the mean“ dargestellt.

Es wurde die Konzentration der jeweiligen Analyte in der Lösung bestimmt, die durch Resuspension der getrockneten Analyte mit 50 µl Lösungsmittel (Acetonitril [25 %] in Wasser) entstand. Diese wurde als ng/ml angegeben.

In Tabelle 71 ist die jeweilige Anzahl der Proben angegeben, die bei der Auswertung der Ergebnisse miteinander verglichen werden konnten.

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Tabelle 71: Anzahl der Sammelproben, deren Ergebnisse miteinander verglichen wurden. Die in Klammern angegebene Anzahl entspricht den Blindproben

ohne AA, DHA; EPA + AA; DHA, EPA nach 46 h

PBS 3 (1) 3 (1)

LPS (10 µg/ml) 3 (1) 3 (1)

HMGB1 (10 µg/ml) 3 (1) 3 (1)

1 Untersuchung einer induzierten Freisetzung von pro- und anti-inflammatorischen Lipidmediatoren aus den neuronalen sowie glialen Zellen von Primärkulturen der AP

Die Auswertung, der bei der LC-MS/MS Analyse ermittelten Peaks, erfolgte anhand der erstellten Kalibriergerade, ohne Berücksichtigung der deuterierten internen Standards.

Zusätzlich wurden die Ergebnisse mit der jeweiligen Wiederfindungsrate des entsprechenden Lipidmediators korrigiert. Die Wiederfindungsrate wurde aus der gemessenen Konzentration in einer mit Medium angesetzten Standardlösung, die eine definierte Konzentration der Lipidmediatoren enthielt und wie die Proben der SPE unterzogen wurden, ermittelt.

Ohne den Zusatz der Fettsäuren (FS) nach 46 Stunden waren lediglich Prostaglandin D2

(PGD2) (3,74 ng/ml) und PGE2 (8,29 ng/ml) in nur einem Überstand der mit LPS stimulierten Primärkulturen nachweisbar. In allen anderen Proben gelang der Nachweis der Lipidmediatoren ohne den Zusatz der FS, aus denen sie metabolisiert werden, nicht (Abbildung 35).

In den Überständen der Primärkulturen, denen die FS AA, DHA und EPA nach 46 Stunden hinzugefügt wurden, konnte hingegen ein zuverlässiger Nachweis von PGD2, PGE2, PGJ2

und LTB4 in allen untersuchten Proben erfolgen. Die anti-inflammatorischen bzw. pro-entzündungsauflösenden Lipidmediatoren Maresin 1 und Neuroprotektin D1 waren hingegen nur in sehr geringen Konzentrationen und nur in wenigen Probenüberständen messbar. Die für Maresin 1 und Neuroprotektin D1 dargestellten Konzentrationen repräsentieren lediglich die Ergebnisse der technischen Replikate einer biologischen Probe, da diese Metaboliten jeweils nur in einer der drei Proben nachweisbar waren. Es erfolgte demnach keine statistische Auswertung der Konzentrationen von Maresin 1 und Neuroprotektin D1. Dennoch soll gezeigt werden, dass mit der hier etablierten Methode prinzipiell ein Nachweis dieser anti-inflammatorischen Mediatoren ebenfalls möglich war.

Ein behandlungsabhängiger Effekt war für keinen der Lipidmediatoren zu erkennen.

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Abbildung 35: Darstellung der Konzentrationen von Lipidmediatoren in Überständen von Primärkulturen der AP in Abhängigkeit ihrer Behandlung

Die als „mean of the mean” mit Standardfehlern dargestellten Konzentrationen wurden mittels LC-MS/MS bestimmt. Die Quantifizierung erfolgte ohne den internen Standard mit Hilfe der erstellten Kalibriergerade und einer Korrektur mit der jeweiligen Wiederfindungsrate. Die statistische Auswertung der Proben ohne und mit Zusatz der Fettsäuren Arachidonsäure (AA), Docosahexaensäure (DHA) und Eicosapentaensäure (EPA) wurde getrennt voneinander durchgeführt. Die Probenzahlen sind der Tabelle 71 zu entnehmen. Ein zuverlässiger Nachweis der Lipidmediatoren erfolgte nur in Proben, denen die Fettsäuren AA, DHA und EPA zugesetzt wurden.

Die anti-inflammatorischen Mediatoren Maresin 1 und Neuroprotektin D1 konnten jeweils nur in einer Probe detektiert werden und wurden statistisch nicht ausgewertet.

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1.1 Darstellung des Nachweises der anti-inflammatorischen Lipidmediatoren