Ge- und Verbrauchsmaterialien für die Arbeit mit „Fat Explants“
Tabelle 30: Für die Arbeit mit „Fat Explants“ benötigte Ge- und Verbrauchsmaterialien
Bezeichnung Typ Hersteller
Multi-Wellplatten 12-fach Greiner Bio-One GmbH,
D-Frickenhausen
Operationsbesteck Aesculap, Tuttlingen
Petrischalen Plastik, 100 x 20 / 35 x 10 mm Sarstedt AG und Co. KG, D-Nümbrecht
Chemikalien für die Arbeit mit „Fat Explants“
Tabelle 31: Für die Arbeit mit „Fat Explants“ benötigte Chemikalien
Bezeichnung Hersteller
2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-Piperazinyl)-Ethansulfonsäure (HEPES) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, D-München Aqua ad iniectabilia (Aqua dest.) B. Braun Melsungen AG, D-Melsungen Biglycan from bovine articular cartilage,
Lot: 033M4046V Sigma-Aldrich Chemie GmbH, D-München
Biglykan Stocklösung (1000 µg/ml) Lösen von Biglykan in PBS (pyrogenfrei) Biglykan Stocklösung (100 µg/ml) Verdünnung der Stocklösung [1000 µg/ml] 1:10
mit PBS (pyrogenfrei) disulfide High-Mobility Group Box-1, LPS free
(HMGB1), Lot: 170823, 18050P, 180720, 671121 HMGBiotech S.r.l., Mailand, Italien HMGB1 Stocklösung [100 µg/ml] Lösen von HMGB1 in sterilem Aqua dest.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient
Mixture F-12 (DMEM/F12) Invitrogen, D-Darmstadt Dulbecco‘s Phosphate Buffered Saline PAA GmbH, A-Pasching Ethanol, vergällt (ETOH) Stockmeier GmbH & Co. KG,
D-Dillenburg
Fetales Kälberserum (FKS) PAA GmbH, A-Pasching
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+-
und Mg2+-frei Biochrom AG, D-Berlin
Lipopolysaccharid (LPS) (E. coli, Serotyp
0111:B4), Lot: 043M4104 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, D-München LPS Stocklösung [1000 µg/ml] Lösen von LPS in PBS (pyrogenfrei)
LPS Stocklösung [100 µg/ml] Verdünnung der Stocklösung [1000 µg/ml] 1:10 mit PBS (pyrogenfrei)
LPS Stocklösung [10 µg/ml] Verdünnung der Stocklösung [100 µg/ml] 1:10 mit PBS (pyrogenfrei)
Penicillin / Streptomycin Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham, MA, USA
Bei Fettgewebe handelt es sich um einen wichtigen Syntheseort für Zytokine und Adipokine.
Allerdings konnte nachgewiesen werden, dass weniger die Adipozyten als die fettgewebsassoziierten Zellen für die Sekretion vieler der entzündungsfördernen Mediatoren verantwortlich sind. Die Sekretion von Adiponektin und Leptin erfolgt hingegen durch
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Adipozyten [433]. Während systemischer Entzündungsreaktionen trägt Fettgewebe also zur Bildung zirkulierender Immunmediatoren bei. Damit beeinflusst es die Gesamtreaktion auf inflammatorische Stimuli [434]. Fettgewebskulturen stellen ein geeignetes und wichtiges Modell bei der Untersuchung der Bedeutung des Fettgewebes für den Verlauf systemischer Entzündungen dar. Sie bieten den Vorteil, dass die Sekretion aller im Fettgewebe enthaltenen Zelltypen bei einer Erhaltung des physiologischen „crosstalks“ der verschiedenen Zelltypen gemessen werden kann. Das hierfür verwendete Protokoll wurde von Pohl et al. (2009) etabliert und in vorherigen Studien im eigenen Haus bereits verwendet [287, 289]. Im Verlaufe dieser Arbeit werden diese ex vivo Fettgewebskulturen als „Fat Explants“ bezeichnet.
Bei den hier durchgeführten „Fat Explant“ Untersuchungen fand weißes- und braunes Fettgewebe Verwendung. Es wurde von jungen (2 Monate) und alten (2 Jahre) Ratten entnommen und vergleichend mit LPS, HMGB1, Biglykan oder PBS stimuliert. Anschließend erfolgte eine Analyse sezernierter Zytokine (Bioassay, siehe Kapitel IIIE2) und Adipokine („enzyme-linked immunosorbent assay“ (ELISA), siehe Kapitel IIIE5) sowie der relativen Expression verschiedener Rezeptoren im subcutanen Fettgewebe (RT-PCR, siehe Kapitel IIIE3).
Das für diesen Versuch verwendete Fettgewebe stammte von Ratten, deren Tötung für die Entnahme des Darmes durch die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Martin Diener des Instituts für Veterinär-Physiologie und –Biochemie der JLU Gießen durchgeführt wurde. Diese Tötung zur Organentnahme wurde zuvor beim Regierungspräsidium Gießen angezeigt (485-M).
2.1 Präparation der Fat Explants Lösungen und Puffer
Tabelle 32: Für die Präparation der „Fat Explants“ benötigte Lösungen und Puffer
Bezeichnung Zusammensetzung
PBS Waschlösung 500 ml PBS
6 ml Penicillin / Streptomycin HBSS-Puffer für die „Fat Explants”
500 ml HBSS
5 ml Penicillin / Streptomycin 7,5 ml HEPES
DMEM/F12 mit Serum
200 ml DMEM/F12 10 ml FKS
2 ml Penicillin / Streptomycin 3 ml HEPES
DMEM/F12 ohne Serum
300 ml DMEM/F12
3 ml Penicillin / Streptomycin 4,5 ml HEPES
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2.1.1 Durchführung der Präparation
Aufgrund des unterschiedlichen Fettgehaltes der jungen und alten Ratten wurde pro Versuchstag Fettgewebe einer alten Ratte oder zwei junger Ratten, die gemeinsam genügend Fettgewebe für die Versuchsdurchführung aufwiesen, isoliert. Die Tötung der Tiere erfolgte durch Betäubungsschlag und Entbluten. Nach der sauberen Entnahme des Darmes wurde subcutanes Fettgewebe isoliert. Die Entnahme erfolgte beidseits in der Leistengegend, wo es sich caudal zwischen Subcutis und Muskulatur befand.
Entlastungsschnitte entlang der Rippenbögen ermöglichten das Wegklappen der Muskulatur, was neben der Vermeidung von Kontaminationen auch der Raumgewinnung für die weitere Präparation diente. Epididymales Fettgewebe wurde beidseits dorsal der Hoden entlang der Samenleiter entnommen. Eine Entnahme von retroperitonealem Fettgewebe fand beidseits retroperitoneal des caudalen Nierenpols statt. Bei der Präparation junger Ratten wurde das Fettgewebe beidseits entnommen und zusammengetragen. Das Fettgewebe der gleichen Lokalisation der zweiten jungen Ratte stellte die zweite Gruppe für die Randomisierung dar, welche bei den alten Ratten entsprechend von dem entnommenen Fettgewebe der linken oder der rechten Seite gebildet wurden (Abbildung 16).
Anschließend wurde die Ratte umgelagert und auf den Bauch gelegt. Die Haut im Schulterbereich wurde großzügig mit Ethanol (70 %) übergossen und darauf folgend von der Muskulatur getrennt. Braunes Fettgewebe war sowohl bei jungen als auch bei alten Ratten in großen Mengen zu isolieren. Es befand sich als Kissen zwischen der Muskulatur der Schulterblätter und war makroskopisch deutlich als braunes Fettgewebe zu erkennen.
Alle Fettgewebe wurden unmittelbar nach der Entnahme entsprechend ihrer Lokalisation sowie der Seite ihrer Entnahme (links / rechts bzw. Ratte 1 / Ratte 2 [bei jungen Ratten]) getrennt und in zuvor beschriftete, mit kalter PBS Waschlösung gefüllte Röhrchen überführt.
Dieser Waschschritt diente der Entfernung von eventuell anhaftenden Haaren und möglichen groben Kontaminationen. Deren Eintrag konnte zwar während der Präparation weitgehend verhindert werden, war aber nicht mit Sicherheit auszuschließen. Anschließend wurde das Fettgewebe in neue, mit kaltem HBSS-Puffer gefüllte Röhrchen gegeben und bis zur Beendigung der Präparation auf Eis gelagert.
Es schloss sich eine Überführung des Inhalts der Röhrchen in Petrischalen an, in denen die Fettgewebe in einen cranialen, medialen und caudalen Anteil separiert wurden.
Anschließend erfolgte eine Zerkleinerung in etwa 60 mg schwere Fettgewebsstücke. Die Durchführung aller weiteren Schritte fand unter einer sterilen Arbeitsbank statt. Damit möglicherweise lokal vorliegende Veränderungen keine Auswirkung auf die Untersuchungen hatten, wurden die Fettgewebsstücke nach einem festgelegten Randomisierungsschema in
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die „Wells“ der Multi-Wellplatten gegeben (Abbildung 16). Diese „Wells“ enthielten bereits 2 ml des HBSS-Puffers. Nachdem das Fettgewebe dreimalig mit HBSS-Puffer gewaschen wurde, erfolgte ein Befüllen der „Wells“ mit 2 ml des angewärmten Mediums (DMEM/F12 mit Serum). Anschließend wurden die „Fat Explants“ für 24 Stunden im Brutschrank bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 mit dem serumhaltigen DMEM/F12 inkubiert.
Abbildung 16: Darstellung der Randomisierung des gewonnenen Fettgewebes für die „Fat Explants“
Die Abbildung zeigt die Randomisierung am Beispiel des subcutanen Fettgewebes. Zunächst wurde das gewonnene Fettgewebe einer Körperseite (bzw. einer jungen Ratte) in einen cranialen, medialen und caudalen Anteil getrennt. Anschließend wurden die etwa 60 mg schweren Fettgewebsstücke dieser Anteile separiert voneinander gesammelt (1-6). Jedes „Well“ erhielt drei Fettgewebsstücke aus unterschiedlichen, zuvor definierten Gruppen, sodass acht verschiedene „Fettgewebsmischungen“
entstanden (A-H), die letztendlich einer Vermeidung lokalitätsbedingter Artefakte dienten.
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2.2 Stimulation der „Fat Explants“
Lösungen und Puffer
Tabelle 33: Für die Stimulation der „Fat Explants“ benötigte Lösungen und Puffer
Bezeichnung Zusammensetzung (pro Multi-Wellplatte)
Biglykan [1 µg/ml] 5940 µl DMEM/F12 ohne Serum
60 µl Biglykan Stocklösung [100 µg/ml]
HMGB1 [1 µg/ml] 5940 µl DMEM/F12 ohne Serum
60 µl HMGB1 Stocklösung [100 µg/ml]
LPS [0,1 µg/ml] 2970 µl DMEM/F12 ohne Serum
30 µl LPS Stocklösung [10 µg/ml]
LPS [10 µg/ml] 5940 µl DMEM/F12 ohne Serum
60 µl LPS Stocklösung [1000 µg/ml]
PBS 5940 µl PBS
60 µl PBS 2.2.1 Durchführung der Stimulation
Nach der 24-stündigen Regenerationsphase begann der eigentliche Versuch. Dafür wurde serumfreies Medium verwendet (DMEM/F12 ohne Serum). Mit diesem wurden auch die Stimulationslösungen entsprechend der Tabelle 33 angesetzt. Zunächst wurde das Fettgewebe einmalig mit 2 ml des serumfreien DMEM/F12 Mediums gewaschen, um das Serum des Vortages zu entfernen. Anschließend wurden die „Wells“ mit 2 ml der Stimulationslösung befüllt.
Für jedes biologische Replikat wurden drei technische Replikate der Stimulation des subcutanen, retroperitonealen und epididymalen Fettgewebes mit Biglykan [1 µg/ml], HMGB1 [1 µg/ml] und PBS durchgeführt. Für die Stimulation mit LPS [0,1 µg/ml] wurde hingegen kein technisches Replikat angefertigt, da es sich bei der Stimulation des subcutanen, retroperitonealen und epididymalen Fettgewebes mit LPS um eine vergleichende Positivkontrolle handelte, die bereits in einer früheren Studie untersucht worden war [289]. Die Stimulation des braunen Fettgewebes erfolgte hingegen lediglich mit LPS [10 µg/ml] und PBS als Kontrolle, wobei hier ebenfalls drei technische Replikate beider Stimulationen durchgeführt wurden. Untersuchungen zum braunen Fettgewebe waren durch Koenig et al. (2014) nicht durchgeführt worden.
Die Multi-Wellplatten wurden für weitere 24 Stunden im Brutschrank bei 37 °C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 inkubiert. Anschließend erfolgte eine portionierte Überführung der Überstände in 1,5 ml Reaktionsgefäße. Es wurde 1 ml des Überstandes für die Zytokinanalysen und 1 ml für die Adipokinanalysen zur Verfügung gestellt. Das Fettgewebe wurde in 2 ml Reaktionsgefäße gegeben und gegengewogen, um die Zytokin- und Adipokin-Synthese rechnerisch auf ein einheitliches Feuchtgewicht von 1 g normalisieren zu können.
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Sowohl die abgenommenen Überstände als auch die Fettgewebsstücke der einzelnen
„Wells“ wurden bis zu ihrer weiteren Verarbeitung bei –22 °C gelagert.