Grundlagen der Methode

MATERIAL UND METHODEN | 132

Abbildung 20: Schematische Darstellung der Arbeitsabläufe zur Analyse von Lipiden und Lipidmediatoren in Zellkulturüberständen von Primärkulturen der AP

Zunächst wurden die Primärkulturen der AP stimuliert und die gewonnenen Überstände bei -80°C aufbewahrt (Abbildung 10). Als Probenvorbereitung erfolgte eine Verdünnung der Probenlösung zur Reduktion des prozentualen Methanolgehaltes. In der anschließenden Festphasenextraktion wurden die gesuchten Analyte aufkonzentriert. Die Flüssigchromatographie mit Massenspektrometriekopplung setzte sich aus einer Ultra-Hochleistungsflüssigchromatographie, einer Ionisierung durch die Elektrosprayionisation und einer Massenspektrometrie zusammen. Die Auswertung der Ergebnisse bedarf Erfahrung und wurde von Dr. Sabine Schulz durchgeführt.

MATERIAL UND METHODEN | 133

verwendet wird. Außerdem kann im Anschluss an die SPE ein Wechsel des Probenmediums hin zu einer für die Flüssigchromatographie besser geeigneten Lösung erfolgen. Das Funktionsprinzip beruht auf den Wechselwirkungen einer flüssigen (mobile Phase) mit einer festen Phase (stationäre Phase), dem Sorbens, und gleicht dem Funktionsprinzip der Hochleistungsflüssigchromatographie („high performance liquid chromatography“, HPLC).

Eine nach oben offene Kartusche enthält das Sorbens, durch welches die Lösungsmittel sowie die Probe von oben hindurch befördert werden können. Am unteren Ende der Kartusche befindet sich ein Auslass für die durch das Sorbens gelaufene Flüssigkeit. Die Flüssigkeit wird in der Regel durch leichten Druck oder Vakuum transportiert. Während der SPE finden grundsätzlich die nachfolgend beschriebenen, aufeinander aufbauenden Schritte statt. Zunächst erfolgt eine Konditionierung der Säule. Die dabei stattfindende Benetzung des Sorbens ist für die Wechselwirkung mit den Analyten und deren Adsorption essentiell. Im Anschluss erfolgt eine Equilibrierung mit einer flüssigen, der Probe ähnelnden Phase. Dieser Schritt ist nicht in jedem Protokoll vorgesehen, wurde aber bei der hier vorliegenden Arbeit durchgeführt. Dann wird die Säule mit der zu analysierenden Probe beladen. In einem anschließenden Waschschritt werden Störkomponenten vom Sorbens gelöst und verworfen.

Schließlich werden die Analyte mit einem geeigneten Eluenten von der Säule gelöst und in einem Reaktionsgefäß aufgefangen. In diesem letzten Schritt wird die Säule komplett trocken laufen gelassen, um eine Retention der Analyte durch das Sorbens zu verhindern.

Eine weitere Konzentrierung kann durch die Verdampfung des Eluenten und eine Resuspension mit einem geringen Volumen des Laufmittels der Flüssigchromatographie erfolgen.

4.1.2 Hochleistungsflüssigchromatographie

Bei der HPLC handelt es sich ebenfalls um ein chromatographisches Trennverfahren, das auf einer unterschiedlichen Polarität der Säule (stationäre Phase) und des Laufmittels (mobile Phase) beruht. Bei der häufig angewendeten Umkehrphasen HPLC wird mit einer unpolaren stationären Phase und einer polaren mobilen Phase gearbeitet. Das Prinzip der flüssigchromatographischen Trennung der Analyte beruht auf den Van-der-Waals Kräften.

Die Analyte wechselwirken unterschiedlich stark mit der stationären Phase. Je mehr der Analyt der stationären Phase ähnelt, desto stärker sind die Wechselwirkungen mit der Säule und desto später wird dieser durch die mobile Phase von der Säule eluiert. Unpolare Analyte werden bei der Umkehrphasen HPLC demnach später eluiert als polare Analyte. Die bis zur Elution benötigte Zeit wird Elutions- oder Retentionszeit genannt [449].

Bei der HPLC handelt es sich um eine Flüssigchromatographie mit einer sehr guten

MATERIAL UND METHODEN | 134

der stationären Phase bedingt ist. Da die mobile Phase deshalb mit hohem Druck durch die Trennsäule bewegt werden muss, wird für die HPLC oft auch der Begriff der Hochdruckflüssigchromatographie verwendet. Bei der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten Ultra-Hochleistungsflüssigchromatographie („ultra high performance liquid chromatography“, UHPLC) kann die mobile Phase durch das Aufbringen eines noch höheren Druckes durch eine stationäre Phase mit noch geringeren Korndurchmessern befördert werden. Das führt zu einer ultraschnellen und hochauflösenden Trennung der Analyte.

Die aufgetrennten Analyte werden anschließend der Elektrosprayionisation (ESI) unterzogen und damit dem Massenspektrometer zugeführt.

4.1.3 Massenspektrometrie

Mit Hilfe der Massenspektrometrie wird das Masse-zu-Ladungs-Verhältnis (m/z) freier Ionen im Hochvakuum bestimmt. Aufgrund der Funktionsweise des Massenspektrometers besteht es grundsätzlich aus drei Komponenten: einer Ionenquelle, einem Analysator mit dem Ziel der Ionentrennung und einem Detektor. Die gewünschte Beschleunigung durch ein elektrisches und gegebenenfalls auch ein magnetisches Feld kann nur bei Ionen erfolgen.

Eine Überführung der neutralen Moleküle in negativ oder positiv geladene Ionen mit Hilfe der Ionenquelle ist deshalb für die massenspektrometrische Detektion unerlässlich. Außerdem muss innerhalb des Massenspektrometers ein Hochvakuum vorliegen. Dieses verhindert Kollisionen der Ionen mit Luft- und Gasteilchen und erlaubt eine ungestörte Bewegung der Ionen entsprechend der vom Gerät erzeugten elektrischen bzw. magnetischen Felder. Bei den Detektoren handelt es sich üblicherweise um Sekundärelektronenverstärker, bei denen ein auftreffendes Ion zu einer Freisetzung vieler Elektronen führt. Die einzelnen Bestandteile (Ionenquelle, Analysator, Detektor) sind in unterschiedlicher technischer Ausführung erhältlich und arbeiten nach unterschiedlichen Funktionsprinzipien.

Elektrosprayionisation als Ionenquelle

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die ESI als Ionenquelle verwendet. Dabei handelt es sich um ein homogenes Ionisationsverfahren, bei dem die Analytmoleküle keinem Temperaturgradienten ausgesetzt sind und auch empfindliche Moleküle unzersetzt verdampft werden können. Es eignet sich gut für die Kopplung an die Flüssigchromatographie, da die Gewinnung der Ionen aus einer Lösung erfolgt.

Bei der ESI wird die Analytlösung durch eine Metallkapillare geleitet, an deren Spitze eine Spannung angelegt wird. Dadurch entsteht ein elektrisches Feld zwischen der Kapillare und der am Massenspektrometer befindlichen Gegenelektrode. Auf diese Weise bewegen sich die in der Analytlösung befindlichen Ionen auf den jeweiligen Gegenpol zu. An der Spitze der

MATERIAL UND METHODEN | 135

Kapillare kommt es zu einem Überschuss gleichartig geladener Ionen, die sich gegenseitig abstoßen und dadurch den sogenannten Taylor-Konus bilden. Diese kegelförmige Deformation einer Flüssigkeitsoberfläche entsteht in einem elektrischen Feld und wird bei einem Überschreiten der kritischen Feldstärke instabil. Bei der ESI führt diese Überwindung der Oberflächenspannung zur kontinuierlichen Emission eines dünnen Flüssigkeitsfadens („Jet“) an der Spitze des Taylor-Konus. Dieser Flüssigkeitsfaden zerfällt unmittelbar nach seiner Emission in kleine, unipolar aufgeladene Tropfen. Durch die Verdampfung des Lösungsmittels wird der Radius der Tropfen kleiner und damit die Abstoßung gleicher Ionen innerhalb des Tropfens stärker [450, 451]. Es bestehen im Wesentlichen zwei Theorien, die die eigentliche Bildung der in der Gasphase befindlichen Analytionen aus diesen instabiler werdenden Tropfen beschreiben [452]. Eine der Theorien („Charge Residue Model“) geht von einem fortlaufenden Zerfall der größeren Tröpfchen in immer kleiner werdende Tröpfchen aus, bis diese schließlich nur noch aus einem Ion und dem Lösungsmittel bestehen (Abbildung 21). Die andere Theorie („Ion Evaporation Model“) geht hingegen von der Emission einzelner solvatisierter Ionen aus den größeren Tröpfchen aus. In beiden Fällen liegen durch eine Verdampfung des verbleibenden Lösungsmittels schließlich die freien Ionen vor.

Durch die Art der an der Kapillare angelegten Spannung wird die Ladung der erzeugten Ionen bestimmt. Positiv geladene Ionen werden beispielsweise durch eine positive Spannung produziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden negative Ionen gemessen, die durch eine negative Spannung an der Kapillare erzeugt wurden.

MATERIAL UND METHODEN | 136

Abbildung 21: Schematische Darstellung der Entstehung von Analytionen bei der Elektrosprayionisation

Die Probenlösung wird durch eine Elektrospraykapillare geleitet, an der eine Spannung angelegt wurde. Am Massenspektrometer befindet sich die Gegenelektrode. So werden in dem hier dargestellten Beispiel die negativ geladenen Ionen zum Massenspektrometer bewegt. Durch das Gegenspiel der Oberflächenspannung und der Stärke des elektrischen Feldes entsteht ein Taylor-Konus an der Kapillare. Aus diesem wird Flüssigkeit in Form eines „Jets“ entlassen. Die daraus resultierenden Tropfen reduzieren ihr Volumen durch Verdunstung. Schließlich werden Analytionen aus den Tropfen freigesetzt und in das Massenspektrometer überführt. (Modifiziert nach [452]).

Analysator und Detektor

Der Analysator des Massenspektrometers dient der Auftrennung von Ionen nach ihrem Masse-zu-Ladungs-Verhältnis. Es stehen Analysatoren unterschiedlicher Funktionsweisen zur Verfügung (zur Übersicht [451, 453]).

Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurde ein Hybrid-Quadrupol-Orbitrap Massenspektrometer (Q Exactive, Thermo Scientific, D-Dreicheich) verwendet. Dieses Massenspektrometer nutzt den Quadrupol zur Selektion von Vorläuferionen und die Orbitrap als Analysator sowie Detektor der vom Quadrupol durchgelassenen Ionen.

Der Quadrupol wird aufgrund seines Funktionsprinzips auch als Massenfilter bezeichnet. Er besteht aus vier parallel und senkrecht zueinander liegenden Stabelektroden. Die Selektion der Ionen erfolgt aufgrund ihrer m/z-spezifischen Flugbahn in den aus Gleich- und Wechselspannung aufgebauten elektrischen Feldern. Die gegenüberliegenden Elektrodenpaare weisen die gleiche Polarität der Gleichspannung und die gleiche Phase der Wechselspannung auf. In den benachbarten Stabelektroden liegt hingegen eine entgegengesetzte Polarität vor. Durch Gleichspannung werden die Ionen zwischen den Elektroden gehalten. Eine angelegte Wechselspannung führt mit einer Radiofrequenz zu

MATERIAL UND METHODEN | 137

einer periodischen Anziehung und Abstoßung der Ionen. Durch die variable Stärke der angelegten Gleichspannung und durch die variable Frequenz sowie Amplitude der angelegten Wechselspannung verändert sich die Flugbahn der Ionen in Abhängigkeit ihres m/z. Je nach Stärke der anliegenden elektrischen Felder bewegen sich also Ionen bestimmter m/z in einer stabilen, oszillatorischen Flugbahn oder in einer instabilen Flugbahn.

Nur die Ionen mit stabiler Flugbahn können den Quadrupol passieren. Eine Veränderung überführt Ionen eines anderen m/z auf die stabile, oszillatorische Flugbahn, wodurch ein Scan des gesamten Massenbereiches möglich wird.

Bei der Orbitrap handelt es sich um eine Ionenfalle. Sie setzt sich aus einer zentralen spindelförmigen Elektrode und umgebenden Detektorelektroden zusammen. Aufgrund der dezentralen Injektion von Ionen bewegen sich diese auf Kreisbahnen um die zentrale Elektrode herum. Zwei ringförmig um die Zentralelektrode lokalisierte Detektorplatten begrenzen die Orbitrap und erfassen die Bewegungsfrequenz der Ionen. Sie ist abhängig von ihrem m/z. Durch die Fourier-Transformation kann das erhaltene zeitabhängige Summensignal in ein kontinuierliches Frequenzspektrum und schließlich in ein Massenspektrum zerlegt werden. Die Orbitrap ist in der Lage m/z bis auf 1 ppm genau zu bestimmen und stellt somit ein sehr verlässliches System zur Identifizierung der Analyte dar.

Ppm ist die Abkürzung von „parts per million“, steht somit für den millionsten Teil (10^-6) und wird zur Angabe der Massengenauigkeit verwendent.

Im Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)-Modus des Massenspektrometers werden die im Quadrupol ausgewählten Vorläufer in einer Kollisionszelle fragmentiert. Bei der „higher-energy collisional dissociation“ (HCD) findet die kollisionsinduzierte Dissoziation außerhalb der Orbitrap in einer HCD-Kollisionszelle statt. In dieser erfolgt eine Fragmentierung der beschleunigten Molekülionen durch eine Kollision mit neutralen Gasteilchen. Die dabei entstandenen Fragmentionen gelangen anschließend wieder zurück und werden in der Orbitrap anhand ihres m/z aufgetrennt. Da eine derartige Tandem-Massenspektrometrie auch bei dieser Arbeit zur Quantifizierung der Lipidmediatoren angewendet wurde, wird von LC-MS/MS gesprochen.