1 Immunzytochemie / Immunhistochemie
4.2 Durchführung
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einer periodischen Anziehung und Abstoßung der Ionen. Durch die variable Stärke der angelegten Gleichspannung und durch die variable Frequenz sowie Amplitude der angelegten Wechselspannung verändert sich die Flugbahn der Ionen in Abhängigkeit ihres m/z. Je nach Stärke der anliegenden elektrischen Felder bewegen sich also Ionen bestimmter m/z in einer stabilen, oszillatorischen Flugbahn oder in einer instabilen Flugbahn.
Nur die Ionen mit stabiler Flugbahn können den Quadrupol passieren. Eine Veränderung überführt Ionen eines anderen m/z auf die stabile, oszillatorische Flugbahn, wodurch ein Scan des gesamten Massenbereiches möglich wird.
Bei der Orbitrap handelt es sich um eine Ionenfalle. Sie setzt sich aus einer zentralen spindelförmigen Elektrode und umgebenden Detektorelektroden zusammen. Aufgrund der dezentralen Injektion von Ionen bewegen sich diese auf Kreisbahnen um die zentrale Elektrode herum. Zwei ringförmig um die Zentralelektrode lokalisierte Detektorplatten begrenzen die Orbitrap und erfassen die Bewegungsfrequenz der Ionen. Sie ist abhängig von ihrem m/z. Durch die Fourier-Transformation kann das erhaltene zeitabhängige Summensignal in ein kontinuierliches Frequenzspektrum und schließlich in ein Massenspektrum zerlegt werden. Die Orbitrap ist in der Lage m/z bis auf 1 ppm genau zu bestimmen und stellt somit ein sehr verlässliches System zur Identifizierung der Analyte dar.
Ppm ist die Abkürzung von „parts per million“, steht somit für den millionsten Teil (10-6) und wird zur Angabe der Massengenauigkeit verwendent.
Im Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)-Modus des Massenspektrometers werden die im Quadrupol ausgewählten Vorläufer in einer Kollisionszelle fragmentiert. Bei der „higher-energy collisional dissociation“ (HCD) findet die kollisionsinduzierte Dissoziation außerhalb der Orbitrap in einer HCD-Kollisionszelle statt. In dieser erfolgt eine Fragmentierung der beschleunigten Molekülionen durch eine Kollision mit neutralen Gasteilchen. Die dabei entstandenen Fragmentionen gelangen anschließend wieder zurück und werden in der Orbitrap anhand ihres m/z aufgetrennt. Da eine derartige Tandem-Massenspektrometrie auch bei dieser Arbeit zur Quantifizierung der Lipidmediatoren angewendet wurde, wird von LC-MS/MS gesprochen.
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Die weitere Bearbeitung der Proben führte ich im Institut für Anorganische und Analytische Chemie mit fachlicher Unterstützung von Dr. Sabine Schulz durch. Diese Arbeitsschritte werden nachfolgend genauer beschrieben.
Die in der hergestellten Standardlösung enthaltenen Lipide und Lipidmediatoren dienten zunächst der Ausarbeitung eines geeigneten Protokolls für ihre Analyse mit Hilfe der UHPLC und der Massenspektrometrie durch Dr. Sabine Schulz. Sie modifizierte beispielsweise die Zusammensetzung der Laufmittel und die Flussrate an der UHPLC sowie die Fragmentationsenergie des Massenspektrometers, um eine optimale Trennung der Peaks und einen adäquaten Nachweis für die gesuchten Lipide und Lipidmediatoren zu erhalten.
4.2.1 Verdünnung der Proben und Zusatz des internen Standards
Zunächst wurden die Proben mit Wasser verdünnt und mit der internen Standardlösung versetzt. Um eine 10 %-ige Methanol-Probenlösung zu erhalten, wurden 8700 µl Wasser hinzugefügt. Außerdem erfolgte die Zugabe von 6 µl der zuvor hergestellten internen Standardlösung (siehe Tabelle 57). Diese enthielt drei deuterierte Standards, die aufgrund des angelagerten Deuteriums von den intern in der Probe vorhandenen Analyten differenziert werden können und so eine Möglichkeit der Quantifizierung, über die Ermittlung ihrer Wiederfindungsrate, darstellen.
4.2.2 Durchführung der Festphasenextraktion
Mit Hilfe der SPE wurde aus den mit internen Standards versehenen Proben das Medium entfernt und eine Konzentrierung der Analyte durchgeführt. Dazu wurden „Strata-X Polymeric Reversed Phase“ Kartuschen (100 mg/3 ml) verwendet. Diese Kartuschen enthalten 100 mg eines polymerbasierten Umkehrphasensorbens und fassen ein Volumen von 3 ml. Da bei der Durchführung der SPE im Rahmen dieser Arbeit größere Volumina erforderlich waren, wurde die Kartusche mehrmals befüllt. Sofern nicht anders beschrieben, lief das Sorbens dabei allerdings nicht trocken.
An der für die Durchführung der SPE verwendeten Apparatur sind Steckplätze für die Kartuschen vorhanden. Diese befinden sich über einem Auffangbehäter, in dem mit Hilfe einer Pumpe ein leichtes Vakuum erzeugt werden kann. Außerdem besteht die Möglichkeit, eine in dem Auffangbehälter befindliche Auffangwanne gegen einen Reaktionsgefäßständer auszutauschen und so die schlussendlich eluierte Lösung in Reaktionsgefäße zu überführen.
Ein zwischen jeder Kartusche und dem Übergang in den Auffangbehälter befindliches Hahnsystem ermöglichte eine Unterbrechung des Durchflusses, ohne das Vakuum im Auffangbehälter reduzieren zu müssen.
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Die Durchführung der SPE erfolgte nach dem in Tabelle 58 dargestellten Protokoll. Die dort angegebenen Lösungen wurden in die Kartusche pipettiert. Durch Öffnung des Hahnsystems lief die Lösung aufgrund des angelegten Vakuums durch das Sorbens. Erreichte die Flüssigkeitssäule die Oberfläche des Sorbens, wurde durch den Verschluss des Hahnsystems ein Trockenlaufen der Säule verhindert.
Tabelle 58: Versuchsprotokoll für die Durchführung der Festphasenextraktion
Schritt Durchführung Funktion
1 3,5 ml Methanol [100 %] Konditionierung der Säule
2 3,5 ml Wasser Equilibrierung
3
12,3 ml Probe
Reduktion des Vakuums
sehr langsamer Durchlauf
Beladen der Säule mit Probenkomponenten
4 3,5 ml Methanol [10 %] Entfernung von Störkomponenten
5
3 x 500 µl Methanol [100 %]
Reduktion des Vakuums
sehr langsamer Durchlauf Säule muss 3 mal trocken laufen
Elution der Analyte mit
Überführung in Reaktionsgefäße
Im Anschluss an die Elution der Analyte wurde das Methanol mit Hilfe von Stickstoff verdampft.
Nachfolgend wurden 50 µl des Lösungsmittels (Acetonitril [25 %] in Wasser) in das Reaktionsgefäß überführt, um die getrockneten Analyte der Probe zu resuspendieren. Dafür wurden zunächst 30 µl des Lösungsmittels in das Reaktionsgefäß pipettiert, mit dem Vortexer gemischt und anschließend zentrifugiert. Schließlich wurden weitere 20 µl des Lösungsmittels in das Reaktionsgefäß gegeben und erneut nach dem gleichen Prinzip verfahren.
Die auf diese Weise aufkonzentrierte Probenlösung wurde in ein beschriftetes HPLC-Gläschen überführt und in die UHPLC eingesetzt.
4.2.3 Wichtige technische Parameter für die Durchführung der UHPLC
Die Durchführung der Ultra-Hochleistungsflüssigchromatographie erfolgte mit der Dionex UltiMate 3000 RSLC (Thermo Scientific, Germany). Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Prinzip der Umkehrphasen HPLC genutzt. Als stationäre Phase diente dabei eine C18 Säule mit Trimethylsilyl Endkappen mit einer Partikelgröße von 2,6 µm und einer Porengröße von 100 Å. Die verwendete Kinetex®Säule (Phenomenex LTD, Aschaffenburg) wies eine Länge von 100 mm und einen Innendurchmesser von 2,1 mm auf.
Für die Analyse wurden 10 µl der aufbereiteten Probe in das UHPLC-System injiziert. Die
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Initial setzte sich die mobile Phase aus 73 % der mobilen Phase A (Wasser mit 0,1 % Ameisensäure) und 27 % der mobilen Phase B (Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure) zusammen. Innerhalb der ersten 15 Minuten wurde der Laufmittelgradient der mobilen Phase B kontinuierlich bis auf 35 % erhöht. In den darauffolgenden zwei Minuten wurde der Anteil der mobilen Phase B kontinuierlich bis auf 60 % erhöht und anschließend in weiteren zehn Minuten kontinuierlich bis auf 80 %. Der Gradient der mobilen Phase A unterlag jeweils einer dementsprechend kontinuierlichen Reduktion. Es lag eine Säulentemperatur von 40°C vor.
4.2.4 Wichtige technische Parameter der angewendeten Massenspektrometrie
Es wurde zunächst eine Vollscan-Massenspektrometrie durchgeführt. Im Anschluss erfolgte eine Fragmentierung definierter Vorläuferionen, also eine gezielte MS/MS. Die Isolationsbreite der Vorläuferionen im Quadrupol lag bei 1 u. Durch diese Angabe wird der Bereich von m/z beschrieben, die sich gleichzeitig auf einer stabilen Flugbahn befinden und das Quadrupol passieren können. Bei der Vollscan-Massenspektrometrie lag eine Massenauflösung von 70.000 vor und die MS/MS wurde mit einer Massenauflösung von 17.500 durchgeführt. Die Massenauflösung beschreibt den minimalen Massenunterschied, der zwischen zwei Ionen bestehen muss, um sie als getrennt detektieren zu können. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die Moleküle im Negativ-Ionen-Modus gemessen und eine HCD Fragmentierung mit einer Fragmentierungsenergie von 35 durchgeführt. Die Messung erfolgte im Negativ-Ionen-Modus und ermittelt wurden Quasi-Molekülionen mit abgespaltetem Proton ([M-H]-). Der Tabelle 59 sind die Ionen mit ihrem m/z und des Zeitfensters ihrer Elution zu entnehmen. Im Falle der FS dienten diese m/z der Quantifizierung. Zur Quantifizierung der Lipidmediatoren dienten die Analytionen als Vorläuferion für die gezielte Fragmentierung. Auch die jeweilige Fragmentationsenergie und der Fragmentionen-Peak, der für die Quantifizierung des jeweiligen Lipidmediators verwendet wurde, sind in Tabelle 59 aufgelistet. Der Tabelle 60 ist die tatsächliche Retentionszeit der verschiedenen Substanzen bei unterschiedlichen Versuchsdurchläufen zu entnehmen.
Jede biologische Probe (siehe Tabelle 71) wurde einer zweimaligen massenspektrometrischen Detektion unterzogen. So ergaben sich die Ergebnisse jedes biologischen Replikats aus den zwei technischen Replikaten.
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Tabelle 59: Auflistung des Zeitfensters der Elution, des m/z der Vorläuferionen und des m/z Fensters für die Peakflächenbestimmung der entsprechenden Substanz. Es wurde eine Fragmentierungsenergie von 35 verwendet.
Substanz Zeitfenster Vorläuferion für MS/M (m/z)
m/z Fenster für
Peakflächenbestimmung
Prostaglandin E2 0 – 10 min 351,21770 271,19 – 271,23
Prostaglandin D2 0 – 10 min 351,21770 271,19 – 271,23
Resolvin D1 0 – 10 min 375,21770 121,0550 – 121,075
Resolvin D1-d5 0 – 10 min 380,24908 121,05 – 121,08
Resolvin D2 0 – 10 min 375,21770 175,05 – 175,1
Prostaglandin J2 10 – 13 min 333,20710 189,1 – 189,16
Leukotrien B4 13 – 18 min 335,22280 59,01 – 59,015
Leukotriene B4-d4 13 – 18 min 339,24789 197,09 – 197,14
Maresin 1 13 – 18 min 359,22280 93,025 – 93,04
Protektin D1 13 – 18 min 359,22280 93,025 – 93,04
Arachidonsäure 18 – 30 min 303,22 – 303,24
Arachidonsäure-d11 18 – 30 min 314,29 – 314,32
Eicosapentaensäure 18 – 30 min 301,21 – 301,23
Docosahexaensäure 18 – 30 min 327,22 – 327,24
Tabelle 60: Auflistung der tatsächlichen Retentionszeit der verschiedenen Substanzen bei unterschiedlichen Messdurchläufen.
Substanz
Durchlauf 1
Retentionszeit (min)
Durchlauf 2 Durchlauf 3
Prostaglandin E2 3,98 3,36
Prostaglandin D2 4,52 3,81
Resolvin D1 8,7
Resolvin D1-d5 6,07 5,17
Resolvin D2 7,2
Prostaglandin J2 8,65 7,52
Leukotrien B4 12,7 11,33
Leukotriene B4-d4 12,57 11,2
Maresin 1 12,55 11,19
Protektin D1 11,95 10,57
Arachidonsäure 22,5 22,34
Arachidonsäure-d11 22,45 22,28
Eicosapentaensäure 21,7 21,52
Docosahexaensäure 22,35 22,18