Während früher angenommen wurde, das Sauerstoffmolekül an sich wäre toxisch für die anaeroben Pansenmikroorganismen, kann heute dank verbesserter Meßtechniken viel genauer differenziert werden.
a) Molekularer Sauerstoff ist toxisch
PASTEUR (1861) fand als erster mit Hilfe von anaeroben Buttersäurebakterien heraus, daß Luft ihrer Motilität und Fermentation schadet. Er postulierte molekularen Sauerstoff als Ursache. Allerdings können Nebenprodukte der Oxidation, wie Wasserstoffperoxid, oder ein erhöhtes Redoxpotential als eigentliche Ursache nicht ausgeschlossen werden. Innerhalb der anaeroben Pansenmikroorganismen gibt es große Unterschiede in der Sauerstoff-empfindlichkeit. Z.B. besitzt das fakultativ anaerobe Lactobacillus plantarum weder Katalase, Peroxidase noch Superoxiddismutase (s. Kap. 2.5.2), ist aber resistent gegenüber Sauerstoff (ARCHIBALD u. FRIDOVICH 1981). MORRIS (1975) führt die Sauerstofftoleranz auf sein Unvermögen der Sauerstoffverwertung zurück und nimmt an, daß erst die Sauerstoffnebenprodukte zur Toxizität führen. Die These, daß molekularer Sauerstoff allein toxisch wirkt, ist demnach nicht haltbar.
b) Änderung des Redoxpotentials durch Sauerstoff
Die Anwesenheit von freiem Sauerstoff ist unvereinbar mit dem Erreichen und Aufrechterhalten des für das Bakterienwachstum notwendigen niedrigen Eh–Werts im Pansen.
Zudem raubt die bevorzugte Reduktion des exogenen Sauerstoffs den Mikroorganismen Reduktionskraft, die sie für die Biosynthese benötigen (MORRIS 1976). Auch ONDERDONK et al. (1976) vermuten, daß die Sauerstofftoxizität auf eine Änderung des Redoxpotentials zurückzuführen ist.
MAROUNEK u. WALLACE (1984) wiesen nach (Untersuchungen von Einflüssen des Redoxpotentials und des Sauerstoffpartialdrucks auf anaeroben Pansenbakterien), daß nicht das Redoxpotential, sondern die Anwesenheit von Sauerstoff der entscheidende toxische Faktor ist. Zu den selben Ergebnissen kamen auch WALDEN u. HENTGES (1975) bei strikten Anaerobiern der menschlichen Intestinalflora. Clostridium acetobutylicum verhält sich in gleicher Weise (O´BRIEN u. MORRIS 1971). Molekularer Sauerstoff oder seine Derivate, und nicht ein hohes Redoxpotential, wirken also toxisch (MORRIS 1979). In Untersuchungen von BARRY et al. (1977) hatte O2 nur geringen Einfluß auf das Redoxpotential.
c) Sauerstoff konkurriert um Elektronen als terminaler Akzeptor
ELLIS et al. (1991 b) untersuchten den Einfluß von O2 auf den Hydrogenosomen besitzenden Ciliaten des Pansens Polyplastron multivesiculatum. Der Ciliat ist empfindlich gegenüber niedrigen Werten von Sauerstoff. O2 konkurriert mit Protonen in den Hydrogenosomen und fungiert als alternativer terminaler Akzeptor für Elektronen, die in der Pyruvatoxidation freigesetzt werden. Auch andere Eukaryonten, die Hydrogenosomen besitzen, sind sauerstoffempfindlich. Durch den alternativen Elektronenakzeptor werden Stoffe, die für biochemische Reaktionen benötigt werden, nicht reduziert (MORRIS 1975).
d) Sauerstoff oxidiert essentielle Thiolgruppen und Enzyme
Die anaeroben Mikroorganismen des Pansens sind sauerstoffempfindlich, da ihr Metabolismus und Wachstum von Schlüsselenzymen abhängig sind, die zur Autoxidation neigen. Dazu gehören z. B. SH-Komponenten, Eisen-Schwefel-Proteine, Tetrahydropteridine und Flavoproteine. Auch kann das Wachstum durch die Oxidation des metabolischen Schlüsselenzyms verhindert werden, vermutlich entweder durch direkte Reaktion mit Sauerstoff oder um im Gleichgewicht mit einem anderen autoxidierbaren Redoxpaar zu sein (MORRIS 1976).
Enzyme, die essentielle Sulfhydrylgruppen enthalten, werden besonders leicht durch Sauerstoff inaktiviert (BARRON 1955; HAUGAARD 1968). Viele Flavoproteine enthalten freie Sulfhydrylgruppen. Hierzu gehören Lipoyl-Dehydrogenase, Succinat-Dehydrogenase, Xanthin-Oxidase, D-Aminosäure-Oxidase, Laktat-Dehydrogenase und Cytochrom c-Reduktase. Viele intrazelluläre Substanzen, wie Metaboliten, Coenzyme oder Metallionen, beeinflussen die Inhibition der Enzyme durch Sauerstoff. Die Zellvermehrung wird stärker als der Energiemetabolismus beeinflußt (z. B. wird das Wachstum von Escherichia coli bei 2 bis 3 atm Sauerstoff gestoppt). WOLIN et al. (1956) zeigten bei Staphylococcus aureus eine Inhibition der Pyruvatoxidation durch Methylenblau oder 1 atm Sauerstoff. Die Zugabe von Mg2+ und Thiamin zum Nährmedium verhütete die toxischen Sauerstoffeffekte.
Die Oxidation von Sulfhydrylgruppen kann nach HAUGAARD (1968) im Zusammenhang mit etlichen toxischen Effekten des Sauerstoffs stehen.
Sauerstoff kann ebenso Ferredoxin, oder inaktive spezifische Enzyme, wie Nitrogenase in nitrogenfixierenden Bakterien, oxidieren (MORRIS 1975). Die Inhibition der bakteriellen Hydrogenase-Aktivität ist wahrscheinlich auf Autoxidation von Ferredoxin zurückzuführen (HAUGAARD 1968). Ferredoxin ist in vielen Bakterien, einschließlich Clostridien, vorhanden (FREDERICKS u. STADTMAN 1965). Die Oxidation von Ferredoxin kann eine Rolle bei der Sauerstofftoxizität bei vielen Organismen spielen (HAUGAARD 1968).
Eine Inhibition hydrolytischer Enzyme zeigten ROSENBAUM et al. (1966) in vivo. Sie setzten Protozoen der Art Paramecium caudatum einem erhöhten Sauerstoffpartialdruck aus.
Innerhalb von zwei Stunden war die enzymatische Aktivität um 90 % verringert.
Obwohl Sauerstoff das Oxidationsmittel mit dem höchsten Oxidationspotential ist, ist es gleichzeitig das langsamste Oxidans. Die Bindung zwischen den Sauerstoffatomen ist so stark, daß die Oxidation durch Sauerstoff mit der Bildung von freien Radikalen eingeleitet werden muß. Dieses kann z. B. durch hohe Temperatur, Licht (in vitro), Schwermetallen (aus dem Futter) oder ionisierende Strahlung geschehen (HAUGAARD 1968). Die Oxidation von Enzymen kann daher nur langsam ablaufen (Thiolgruppen-Oxidation: 0,2 % min-1; STEES u.
BROWN 1973; MORRIS 1975). Dieses spricht gegen die Oxidation von Enzymen als Hauptursache der Sauerstofftoxizität. Aber sie spielt ohne Zweifel eine Rolle, denn die Inaktivierung von SH-haltigen Enzymen und auch anderen Enzymen wurde oft dokumentiert.
e) Produkte des Sauerstoffs sind toxisch, besonders freie Radikale
Die Toxizität des Sauerstoffs ist den Produkten seiner Interaktion mit dem Organismus und/oder Komponenten dessen Kulturmediums zuzuschreiben. Im Gegensatz zu den aeroben Bakterien fehlen den Pansenanaerobiern Mittel, um diese Substanzen zu detoxifizieren.
Toxische Produkte sammeln sich unter Sauerstoffeinfluß im Nährmedium an, z. B. organische Peroxide, Aldehyde, freie Radikale. Ständig werden toxische Produkte, oder entstehende
Nebenprodukte bei Reaktionen des Sauerstoffs mit reduzierten Zellbestandteilen, wie Eisen-Schwefel-Proteinen, Tetrahydropteridinen oder Flavoproteinen, gebildet. Ebenfalls entstehen toxische Produkte bei der Aktivität bestimmter Oxidasen und Flavindehydrogenasen.
Wasserstoffperoxid, Superoxidanion, Hydroxylradikal und Singulettsauerstoff sind die wichtigsten toxischen Produkte (MORRIS 1976).
In Selenomonas ruminantium wird Sauerstoff durch NADH-Oxidase zu Wasser oder Hydrogenperoxid reduziert, wobei als toxisches Nebenprodukt das Superoxidanion entsteht (MORRIS 1975).
Produkte der Sauerstoffreduktion, wie Superoxidanionen und Hydrogenperoxide, können akkumulieren und Zellschäden verursachen (SAMAH u. WIMPENNY 1982).
Ebenso können die Metaboliten des Sauerstoffs toxisch sein. Dieses sind Singulett-Sauerstoff, Superoxidanion, Wasserstoff und das freie Hydroxylradikal. Die Abwesenheit von Katalase bei Anaerobiern ließ MC LEOD und GORDON (1923) vermuten, daß Wasserstoffperoxid das toxische Reagenz ist. Dieses wird aber 1975 von MORRIS angezweifelt.
GILBERT et al. (1957, 1958) untersuchten den Effekt des Sauerstoffs auf die DNA und Natriumalginat und beobachteten die Bildung von Wasserstoffperoxid unter Sauerstoffeinwirkung. Es wurden Experimente mit reduziertem Glutathion unter verschiedenen Sauerstoffpartialdrücken durchgeführt. Die Wasserstoffperoxidmenge nimmt mit steigendem Sauerstoffdruck zu. GILBERT et al. (1957) postulierten, daß H2O2 bei der Autoxidation des reduzierten Gluthations (GSH) unter Bildung freier Radikale entsteht, wie im folgenden Schema:
Das Peroxidradikal (HO.) oder H2O2 sind verantwortlich für die Depolymerisation der DNA bzw. des Natriumalginats. GILBERT (1963, 1964) wies darauf hin, daß Glutathion als Pro-Oxidant oder als Antioxidant wirken kann. Es kann die Bildung freier Radikale und Perhydroxyl, welche verschiedene reaktive Gruppen oxidieren können, veranlassen. Genauso kann es freie Radikale abfangen.
BROWN et al. (1998) wiesen allerdings daraufhin, daß das einst als ubiquitär vorkommend angesehene Glutathion in vielen Eubakterien und Archebakterien (dazu gehören die Methanbildner) fehlt.
Aus diesen Experimenten entwickelte sich die Theorie, daß die Toxizität des Sauerstoffs auf eine Zunahme freier Radikale im Zellinneren zurückzuführen ist. Die Zerstörung von Enzymen und Zellfunktionen wird demnach durch freie Radikale verursacht.
Der Mechanismus, wie die Freisetzung des Superoxidanionradikals zur Schädigung der Bakterien führt, ist noch nicht ganz geklärt, aber es wird angenommen, daß die Entwicklung weiterer reaktiver Radikale, wie OH., Singulett-Sauerstoff und Hypochlorid oder Hypothiocyanat entscheidend ist (DEL MAESTRO 1980).
FRIDOVICH (1978) und FEE (1980) weisen auf die Bedeutung von O2.- und dessen Stoffwechselprodukten im Rahmen der Sauerstofftoxizität hin. Sie führen unter anderem zur DNA-Depolymerisation, Peroxidation von Lipiden, Depolymerisation von Polysacchariden und Abtötung von Bakterien, Viren und Mycoplasmen. Dieses wird ebenfalls von GREGORY et al. (1973), MICHELSON u. BUCKINGHAM (1974), BABIOR et al. (1975), KELLOG u. FRIDOVICH (1975) und VAN HEMMEN und MEULING (1975) beschrieben.
TALLY et al. (1977) weisen auf die Gefährlichkeit von Superoxidradikalen (O2.-) hin. Sie sind extrem reaktiv und können Zellschäden verursachen.
SIES (1984) faßt die Schäden, die durch O2.-, OH. und 1O2 verursacht werden, folgendermaßen zusammen:
Die DNA wird geschädigt durch eine Steigerung der Mutationsrate und einen Anstieg der Strangbrüche. Es kommt zu einer Enzyminhibition. Lipide werden oxidiert, insbesondere ungesättigte Fettsäuren, verbunden mit Membranzerstörungen.
Außerdem können lebende Zellen durch die Produktion von O2.- geschädigt bzw. abgetötet werden (MICHELSON u. BUCKINGHAM 1974; GOLDBERG u. STERN 1976; KELLOG u. FRIDOVICH 1977).
Mit H2O2 kann O2.- in der sogenannten „Haber-Weiss-Reaktion“, in Anwesenheit von Fe2+ -Ionen als Katalysator, reaktive OH-Radikale bilden (HABER u. WEISS 1934).
Fe2+
O2.- + H2O2 + H+ —→ O2 + H2O + HO.
Mehrere Autoren nehmen an, daß auch in lebenden Zellen diese „Haber-Weiss-Reaktion“
ablaufen kann. Der enzymatische Abbau von O2.- und H2O2 schützt vor OH-Radikalbildung (FRIDOVICH 1972; BORS et al. 1980; HALLIWELL et al. 1980; HASSAN 1983; SIES 1984).
Hingegen zeigt FEE (1980), daß Fe2+ in der Zelle nicht verfügbar ist, sondern als Ferritin, Hämoglobin und Myoglobin im Komplex vorliegt und daher nicht die „Haber-Weiss-Reaktion“ katalysieren kann. Außerdem ist die intrazelluläre H2O2-Konzentration sehr niedrig, während der Gehalt an reduzierbaren Zellstrukturen, die mit O2.- eher reagieren als Fe3+, hoch ist. Daher lehnt er die O2.-Toxizität-Theorie ab und erwähnt in diesem Zusammenhang Versuche, in denen O2.- mit folgenden Komponenten nicht reagiert hat:
Nukleinsäuren, Poliovirus, Cholesterin, H2O2 und Hyaluronsäure.
DI GUISEPPE und FRIDOVICH (1982) führten Versuche mit dem fakultativ anaeroben Keim Streptococcus sanguis (gehört zu den oralen Streptokokken des Menschen, PSCHYREMBEL 1994) durch, um festzustellen, ob die Sauerstofftoxizität auf Superoxidradikale oder Hydroxylradikalbildung zurückzuführen ist. Streptococcus sanguis besitzt eine Magnesium-enthaltende Superoxiddismutase (s. Kap. 2.5.3.1), aber keine Katalase oder Peroxidase. Höhere Werte an Superoxiddismutasen-Aktivität, entstanden durch Sauerstoffeinfluß, schützten vor Schäden durch Sauerstoff, hingegen hatte das Hinzufügen von Katalase keinen schützenden Effekt. Dieses zeigt, daß H2O2 bei Streptococcus sanguis nicht der Faktor in der Sauerstofftoxizität sein kann, und folglich auch nicht das hieraus entstehende Produkt OH. . Daher ist das Superoxidradikal, gegen das die Superoxiddismutase ein Schutzmechanismus darstellt, das toxische Agens der Sauerstofftoxizität bei Streptococcus sanguis. Zu den gleichen Ergebnissen führten Versuche mit Escherichia coli (HASSAN u. FRIDOVICH 1977 a, b, 1979 a, b).
Da Streptococcus sanguis kein Eisen enthält, kann die in vitro demonstrierte Haber-Weiss-Reaktion bei Streptococcus sanguis nicht katalysiert werden, und OH-Radikale können nicht entstehen (DI GUISEPPE u. FRIDOVICH 1982).
MATTILA (1985) stellte bei Untersuchungen mit Staphylococcus aureus und Streptococcus agalactiae hingegen fest, daß Katalase gut vor Sauerstofftoxizität schützte, während Superoxiddismutase einen geringeren Schutzeffekt ausübte.
Für den microaerophilen Campylobacter jejuni wiesen JUVEN und ROSENTHAL (1985) unter Sauerstoffeinfluß höhere Überlebensraten und ein besseres Wachstum nach, wenn dem Nährmedium mehr Katalase hinzugefügt wurde. Hingegen vermochte Superoxiddismutase nicht vor toxischen Effekten des Sauerstoffs zu schützen. Diese Versuchsergebnisse zeigen, daß für Campylobacter jejuni Wasserstoffperoxid ein wichtiger Faktor in der Sauerstofftoxizität ist. Hingegen scheinen Superoxidradikale und das starke Oxidationsmittel OH. aufgrund des fehlenden Schutzes durch Superoxiddismutase hier keine Rolle zu spielen.
Auch die Zugabe des Hydroxylradikal-Fängers Cysteamin zum Nährmedium erhöhte die Erhohlungsrate geschädigter Zellen nicht.
In ihren Versuchen stellten JUVEN und ROSENTHAL (1985) außerdem fest, daß Licht einen großen Einfluß auf die Toxizität hat. Besonders große Effekte der Sauerstofftoxizität zeigten sich bei der Kultivierung der Campylobacter jejuni-Stämme in Licht und aerob. Es konnten um 2 bis 3 log10erniedrigte Auszählungswerte ermittelt werden im Vergleich zu im Dunkeln und unter anaeroben Bedingungen gewachsenen Kulturen (s. Tab. 2.7). Der Pansen ist zwar dunkel, doch die meisten in-vitro Versuche, wie mit dem RUSITEC, werden unter Lichteinfluß durchgeführt.
Tab. 2.7: Wachstum von Campylobacter jejuni auf Nährböden, die unter verschiedenen Lichtbedingungen und Gasatmosphären vor der Beimpfung gelagert wurden (JUVEN u. ROSENTHAL 1985)
Wachstum in Prozent *
Umgebung** Stamm Nr. 2 Stamm Nr. 200 Stamm Nr. 16
Kontrolle
* Beimpfung der Nährböden nach der Lagerungsperiode und Auszählung derer mit 20 – 200 Kolonien und Verrechnung der Ergebnisse als Prozent von den theoretisch
erwarteten bei vorheriger Lagerung von 0,1 ml der korrespondierenden Bakterienverdünnung im Dunkeln unter Lufteinfluß
** 48 h bei 30°C
*** 90 % H2 und 10 % CO2
Insgesamt wird heute die Toxizität des Sauerstoffs auf aktivierte Sauerstoffspezies (s. auch Kap. 2.3) zurückgeführt. Dazu gehören Superoxidanionen, Wasserstoffperoxid, Singulett-Sauerstoff und Hydroxylradikale (CRAPO u. TIERNEY 1974; GREGORY et al. 1974;
FRANK et al. 1978; SHOESMITH u. WORSLEY 1984; TURRENS et al. 1984;
HALLIWELL u. GUTTERIDGE 1985; SOUTHORN u. POWIS 1988; BROWN et al. 1998).
Eine Übersicht der verschiedenen Ursachen und Mechanismen der Sauerstofftoxizität geben Tabb. 2.8 und 2.9.
Tab. 2.8: Zusammenstellung der Literatur zur antimikrobiellen Wirkung von unterschiedlichen O2-Spezies
Verursacher der Toxizität Autor / Jahr
Molekularer Sauerstoff O`BRIEN u. MORRIS 1971
WALDEN u. HENTGES 1975
Wasserstoffperoxid als toxisches Agens MC LEOD u. GORDON 1923 GILBERT et al. 1957, 1958 JUVEN u. ROSENTHAL 1985
HASSAN u. FRIDOVICH 1977 a, b, 1979 a, b
DEL MAESTRO 1980 FEE 1980
DI GUISEPPE u. FRIDOVICH 1982 OH-Radikalbildung durch die
HABER-WEISS-REAKTION aus Superoxidanionen und Wasserstoffperoxid in Anwesenheit von Eisen
Tab. 2.9: Mechanismen der Sauerstofftoxizität
Mechanismus der Toxizität Autor / Jahr O2 wirkt als Oxidant, Eh-Wert ändert sich,
Autoxidation von Schlüsselenzymen
MORRIS 1976
ONDERDONK et al. 1976 O2 ist toxisch, aber nicht die Änderung des
Redoxpotentials Inaktivierung vieler Enzyme, besonders derer,
die Sulfhydrylgruppen enthalten Oxidation von Ferredoxin, das in vielen
Bakterien enthalten ist
GILBERT et al. 1957, 1958 GREGORY et al. 1974
MICHELSON u. BUCKINGHAM 1974 BABIOR et al. 1975
KELLOG u. FRIDOVICH 1975 VAN HEMMEN u. MEULING 1975 FRIDOVICH 1978
FEE 1980 SIES 1984
Membranzerstörung SIES 1984
Zellschäden MICHELSON u. BUCKINGHAM 1974
GOLDBERG u. STERN 1976 KELLOG u. FRIDOVICH 1977 TALLY et al. 1977