Thiobarbitursäure-Reaktive Substanzen, Fluorophotometrische Messung

Testprinzip:

Zur Erfassung des Ausmaßes an Lipidschädigung durch oxidativen Stress wurden die TBARS fluorometrisch nach UCHIYAMA und MIHARA (1978) bestimmt. Die TBARS sind ein Maß für die Konzentration der Carbonylverbindungen in oxidierten Fetten. Die Reaktion von TBA mit MDA, einem sekundären LPOs-Produkt, führt zu einer Komplexbildung, die jedoch nicht spezifisch für MDA ist (POLI et al., 1985; BIRD und DRAPER, 1984). Neben MDA bilden sekundäre und tertiäre Abbauprodukte ungesättigter Fettsäuren wie Aldehyde, Ketone und Gallenpigmente zusammen mit TBA (jeweils ein Molekül mit zwei Molekülen TBA) einen rosafarbenen Trimethin-Farbstoff-Komplex unter Einwirkung von Hitze in einem sauren Milieu. Dieser MDA-TBA-Komplex absorbiert Licht bei 532-553 nm und kann ebenso auch fluorophotometrisch nach Extraktion in Butanol in geringen Konzentrationen bei einer

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Exzitationswellenlänge (Ex) von 515 nm und Emissionswellelänge (Em) von 548 nm nachgewiesen werden (BIRD und DRAPER, 1984).

Testdurchführung im Plasma:

Zunächst wurde 400 µl Plasma in 1,5 ml Kunststoffreaktionsgefäße (Fa. Eppendorf, Hamburg) mit 800 µl 2%-ige meta-H3PO4 pipettiert, kurz vermischt und anschließend bei 14000 x g für 10 Min zentrifugiert. Von den Proben wurden 500 µl Überstand in 10 ml Röhrchen mit teflonbeschichtetem Schraubverschluss überführt. Zusätzlich kamen in jedes Röhrchen 3,0 ml 1%-ige meta-H3PO4-Lösung (Fa. SIGMA-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland), 1,0 ml TBA (150 mg TBA [Fa. SIGMA-Aldrich]/25 ml dest. Wasser) und 300 µl α-Tocopherol (34,2 mg α-Tocopherol [Fa. SIGMA-Aldrich]/10 ml Ethanol). Zur Herstellung des Blindwertes wurde anstelle des Probenanteils 500 µl 0,9%-ige NaCl-Lösung eingesetzt. Eine Standardstammlösung wurde aus 400 µl 0,9%ige NaCl-Lösung und 100 µl 1,1,3,3 Tetraethoxypropan-Standardlösung (120 µl 1,1,3,3 Tetraethoxypropan [Fa. Fluka, Buchs, Schweiz] in 2,0 ml Ethanol/l bi-dest Wasser) hergestellt. Durch Verdünnung von 100 µl dieser Standardstammlösung mit 10 ml bi-destillierten Wassers wurde die Standardlösung mit 0,5 nmol 1,1,3,3 Tetraethoxypropan/ml für den Test hergestellt. Nach Mischen der Testansätze mit Proben, Blindwert oder Standard für 10 sec wurden alle Röhrchen verschlossen und bei 95–100 °C für 45 Min erhitzt sowie anschließend in Eis auf ca. 18–20

°C abgekühlt. Nach Zugabe von jeweils 4,0 ml n-Butanol (Fa. SIGMA-Aldrich) wurden die wiederum verschlossenen Röhrchen 30 Min zum Extrahieren in einem Überkopfmischer (Modell Rotary-Mixer 34526, Fa. SNIJDERS, Tilburg, Holland) geschüttelt. Danach wurde bei 4500 x g 10 Min lang bei Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend wurden 2,0 ml des Butanol-Überstandes in dem Spektralfluorometer (RF 510 Fa. Shimadzu, Kiyoto, Japan) mit folgenden Einstellungen verwendet: Ex: 515 nm, Em: 565 nm, Bandbreite:10 bzw. 40 nm, Verstärkung: 5. Alle Ansätze wurden in Doppelbestimmungen ausgeführt.

48 Auswertung:

Mit Hilfe des mitgeführten Standards aus 1,1,3,3-Tetraethoxypropan in einer Konzentration von 0,05 µmol/l, das sich in dem Testansatz zu einem MDA-TBA-Derivat umsetzt, und des Blindwertes wurde der Gehalt an TBARS in den Proben über eine lineare Gleichung ermittelt.

Die Daten der separat gemessenen Plasmaproteingehalte wurden in die im Folgenden aufgeführte Berechnungsformel einbezogen.

(RFPr – RFBl) × CSt × VF

________________________________

= CPl

(RFSt – RFBl) × ProtPl

RFPr = relative Fluoreszenz der Probe RFSt = relative Fluoreszenz des Standards RFBl = relative Fluoreszenz des Blindwertes

CPl = TBARS-Konzentration der Plasmaprobe (µmol/l) CSt = TBARS-Konzentration des Standards (µmol MDA/l) ProtPl = Gesamtproteinkonzentration der Plasmaprobe (g/l) VF = Verdünnungsfaktor

Testdurchführung für Leberproben:

500 µl des 10%-igen Homogenates wurden abpipettiert und in einem Kunststoffreaktionsgefäß mit 1,0 ml 2%-iger m-H₃PO₄ kurz vermischt und anschließend bei 14000 x g für 10 Min zentrifugiert. Von den Proben wurde 500 µl Überstand in 10 ml- Röhrchen mit teflonbeschichtetem Schraubdeckel überführt. Der anschließende Reaktionsansatz erfolgte unter Zugabe von TBA, α-Tocopherol und meta-Phosphorsäure entsprechend dem oben beschriebenen Ansatz für Plasmaproben sowie der anschließenden Extraktion mit Butanol. Nach Zentrifugation wurde der gewonnene Butanolüberstand unter gleichen Bedingungen wie bei der Bestimmung im Plasma im Fluorophotometer vermessen.

Im Hinblick auf die Auswertung wurde ein Aliquot des 10%-igen Leberhomogenates einer Messung der Gesamtproteinkonzentration unterzogen.

49 Auswertung:

Unter Einbeziehung der Tetraethoxypropan-Standard-Werte und der ermittelten Proteingehalte im Leberhomogenat konnte die Konzentration der TBARS als MDA-Konzentration in µmol/g Leberprotein nach folgender Formel berechnet werden.

(RFPr – RFBl) × CSt × VF

________________________________

= CLeb

(RFSt – RFBl) × ProtLeb

RFPr = relative Fluoreszenz der Probe RFSt = relative Fluoreszenz des Standards RFBl = relative Fluoreszenz des Blindwertes

CLeb = TBARS-Konzentration der Leberprobe (µmol/g) CSt = TBARS-Konzentration des Standards (µmol MDA/l) ProtLeb = Proteinkonzentration der Leberprobe (g/l) VF = Verdünnungsfaktor

3.4.2 Malondialdehydmessung mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Das „Reagenzienkit für die HPLC-Analytik von Malondialdehyd im Plasma/Serum CHROMSYSTEMS^®“ der Firma CHROMSYSTEMS (München) basiert auf der Bestimmung von MDA in einem chromatographischen Verfahren mit Fluoreszenzdetektion. Die Probenvorbereitung erfolgt zunächst durch Proteinfällung und einer anschließenden Derivatisierung unter Hitzeeinwirkung. Das entstandene fluorophore Derivat wird sodann nach einem isokratischen HPLC-Lauf detektiert. Das Fließmittel sowie die HPLC-Säule sind Bestandteil des Reagenzienkits. Zur Anwendung kam eine HPLC-Pumpe der Firma Knauer bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/Min. Die Detektion erfolgte im Spektralfluorophotometer (Ex: 515 nm, Em: 553 nm).

50 Messung im Plasma:

In einem braunen, lichtundurchlässigen 1,5 ml-Kunststoffreaktionsgefäß wurde 100 µl Probe vorgelegt, 500 µl Präzipitationsreagenz dazugegeben und der Testansatz auf dem Vortexmischer für 10 sec gemischt. Das hierbei ausgefällte Protein wurde 5 Min bei 13.000 U/Min in der Hochgeschwindigkeitstisch-Zentrifuge separiert. 500 µl des Überstandes wurde in ein braunes Glas-Reagenzgefäß überführt. Nach Zugabe von 100 µl Derivatisierungsreagenz wurde das Reagenzgefäß mit einer Teflon-beschichteten Kappe verschlossen. Nach Mischen des Reaktionsansatzes durch Schwenken wurde die Derivatisierung in einem Heizblock bei 95 °C durchgeführt. Nach einer Stunde wurde die Reaktion gestoppt, indem die Gefäße auf Eis abgekühlt und zu dem Ansatz 500 µl Neutralisationspuffer pipettiert wurden. Für die Chromatographie wurden 20 µl des neutralen Produktes eingesetzt.

Messung in der Leber:

Für die Bestimmung der MDA-Konzentration im Leberhomogenat wurde das vorbereitete 10%-ige Homogenat zunächst zu gleichen Teilen mit 0,15 mol/l KCl-Lösung (200 µl 10%iges Homogenat, 200 µl 0,15 mol/l KCl-Lösung) verdünnt, so dass ein 5%-iges Homogenat entstand. 100 µl aus dieser Verdünnung wurden analog zu der oben beschriebenen Methode für Plasmaproben in den Test eingesetzt.

Auswertung:

Die Auswertung der HPLC-Chromatogramme erfolgte über die Chromatographie-Software (Fa. Data-APEX, Prag, Tschechische Republik) und ein Beispiel eines Chromatogramms ist in Abb. 1. Für die Kalibrierung des Chromatographiesystems wurde der im Reagenzienkit mitgelieferte Kalibrierungsstandard von 0,40 µmol MDA/l eingesetzt, der bei jedem Analysengang mitgeführt wurde. Daneben dienten die Kontrollseren der Firma CHROMSYSTEMS^® mit 0,22 und 0,71 µmol MDA/l der regelmäßigen Kontrolle. Für die Auswertung der Leberproben wurde der Leberproteingehalt in den eingesetzten Proben ermittelt und als Bezugssystem in die Berechnung einbezogen.

51

Abb. 1 Beispiel eines Chromatogramms für die Malondialdehydmessung mit HPLC.

3.5 Komet-Test

Der Komet-Test (OSTLING und JOHNSON, 1984) ist ein einfacher, schnell durchführbarer Test, der es erlaubt, DNA-Schäden auf dem Niveau der Einzelzelle zu detektieren (SINGH et al., 1988; FAIRBAIRN et al., 1995). In dieser Arbeit wurde der Test zum Nachweis von DNA-Schäden an einer gereinigten Hundelymphozyten-Fraktion mit geringeren Modifikationen nach JENKINSON et al. (1999) verwendet.

Methodische Vorversuche:

Abweichend von der im Folgenden angeführten Testbeschreibung wurde in Vorversuchen an 10 gesunden Hunden zunächst geprüft, wie sich eine Erhöhung der Standardelektrophoresezeit bei 30 V und 300 mA von 15 Min auf 20 Min auf das Testergebnis auswirkt. Um die Messung mit demselben Elektrophoresegerät durchführen zu können, wurde ein Aliquot der Lymphozytenfraktion für die Untersuchung mit 20 Min Elektrophoresezeit auf Eis gelagert. Weiterhin wurde im Hinblick auf eine verbesserte

0 1 2 3 4 Minuten

0,20

0,15

0,10

0,05

0,00

relative Fluoreszenz

52

Praktikabilität der Testdurchführung bei neun gesunden Hunden geprüft, wie sich eine einstündige Lagerung der Blutproben auf Eis auf das Testergebnis auswirkt. Eine einstündige Lagerung auf Eis wird von einem Teil der Autoren für die Untersuchung von Humanblut als akzeptabel erachtet (JENKINSON et al., 1999). Abschließend wurde die im Komet-Test verwendete Zellfraktion mit Aufkonzentrierung der Lymphozyten (Lymphozyten-Fraktion) mit einem vollautomatischen Hämatologiesystem (ADVIA^® 120, Fa. Siemens Medical Solutions Diagnostics GmBH, Fernwald, Deutschland) nach Zelltypen differenziert sowie ein möglicher Einfluss der Zellfraktion auf das Komet-Testergebnis untersucht.

Testdurchführung:

Frisch in mit EDTA versehene Probengefäße entnommenes Blut wurde nach der Abnahme sofort auf Eis verbracht und unverzüglich aufgearbeitet. Zur Isolierung der Lymphozytenfraktion wurde das Blut, wie oben bereits beschrieben, für die Gewinnung von Li-Heparinat-Plasma in einer auf 4 °C vorgekühlten Zentrifuge 15 Min lang bei 2400 x g zentrifugiert. Der Plasmaüberstand wurde sorgfältig abpipettiert und für einen methodischen Versuch zum Vergleich der Messergebnisse zwischen EDTA- und Li-Heparinat-Plasma sofort im Stickstoff eingefroren und anschließend bis zur Messung bei -196 °C gelagert. Der Buffy-Coat wurde mit Hilfe einer Pasteurpipette abgesaugt und mit RPMI 1640 Medium (Fa.

SIGMA-Aldrich) 1:2 verdünnt. Die Mischung wurde vorsichtig am Rand des Röhrchens auf ein gleiches Volumen Histopaque-NycoPrep™ 1.077 (Fa. AXIS-SHIELD PoC AS, Oslo, Norwegen) geschichtet. Anschließend wurde die Probe für 30 Min bei 20 °C und 700 x g zentrifugiert. Die sich nun in der Mitte zwischen Histopaque und Medium anreichernde Lymphozytenschicht wurde erneut mittels Pasteurpipette gewonnen und in 7,0 ml RPMI 1640

„gewaschen“, d.h. resuspendiert und anschließend zentrifugiert (20 °C, 700 x g, 15 Min).

Nach Abgießen des Überstandes wurde das verbliebene Pellet in Abhängigkeit von der Pelletgröße in ca. 500–1000 µl einer Mischung von RPMI 1640 (9 Teile) und FCS (1 Teil) (RPMI 1640/FCS) in einem neutralen Kunststoffröhrchen vorsichtig resuspendiert. Da teilweise Reste des Pellets, die sich nicht lösen ließen, zurückblieben, wurde die überstehende Suspension abpipettiert und der Gehalt an Lymphozyten sowie mögliche „Kontaminationen“

durch andere Leukozyten (v.a. Neutrophile) und Erythrozyten erfasst. Die Zellzählung erfolgte mit einem vollautomatischen Hämatologiesystem (ADVIA^® 120, Fa. Siemens

53

Medical Solutions Diagnostics GmbH, Fernwald, Deutschland), das neben der Zahl der weißen und roten Blutzellen auch eine zuverlässige Zählung ausgewählter Leukozytenpopulationen wie der Lymphozyten erlaubt.

Wegen der Empfindlichkeit der Lymphozyten-DNA gegenüber Umwelteinflüssen, wie Temperaturschwankungen, Licht und Manipulationsschäden (McKELVEY-MARTIN et al., 1993; TYRRELL, 1995; TICE et al., 2000; ARIMOTO-KOBOYASHI et al., 2002), wurde möglichst zügig gearbeitet. Um eine zeitaufwändige und möglicherweise schädigende Vorbearbeitung der Proben zu vermeiden sowie im Hinblick auf ein möglichst kurzes Intervall von der Probenentnahme bis zur Messung, wurde in der vorliegenden Studie auf weitere „Waschschritte“ verzichtet, da sich zeigte, dass sich die Reinheit in weiteren Waschschritten, orientierend an den Ergebnissen der durchgeführten Waschschritte der ersten Präparationen, nicht wesentlich erhöhen ließ. Für den weiteren Test wurden zwei Objektträger verwendet, pro Objektträger wurden 100 µl Lymphozytensuspension mit insgesamt ca. 100–

200 Zellen/µl benötigt.

Vorbereitung der Objektträger:

Zur Entfettung wurden die Objektträger mit handelsüblicher Scheuermilch und anschließend mit Azeton gewaschen. Reste der Reinigungsmedien wurden durch Spülung mit destilliertem Wasser entfernt. Abschließend wurden die entfetteten Objektträger mit DNA-Agar (Fa.

SIGMA-Aldrich) beschichtet, um eine bessere Anhaftung der anschließend aufgetragenen Zellen in DNA-Agarlösung zu ermöglichen. Hierzu wurde in einem staubfreien Raum auf jeden Objektträger ca. 1,0 ml Agarlösung aus hochschmelzender Agarose aufgetragen und eine Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Zur Herstellung der benötigten Menge an Agaroselösung wurden 5 mg Agar zu 1,0 ml destillierten Wassers gegeben, erwärmt und intensiv durchmischt. Die beschichtete Seite wurde mit Hilfe eines Diamantschreibers bezeichnet.

Probenauftrag:

Von jeder Probe wurden jeweils Doppelmessungen, d.h. Auswertungen von zwei Objektträgern, ausgeführt. Jeweils 100 µl Lymphozytensuspension (mit ca. 100–200 Zellen/µl) wurden in 1,0 ml Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) mit niedrig-schmelzendem

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DNA-Agar (Fa. SIGMA-Aldrich) gegeben, der zuvor auf 37 °C temperiert wurde. Zur Herstellung der PBS-Lösung mit niedrig-schmelzendem DNA-Agar wurde jedes Mal kurz vorher 1,0 ml PBS zu 10 mg dieses Agars pipettiert und im Heizblock auf 95 °C erhitzt und durch Schwenken gemischt sowie anschließend bis auf 37 °C im Wasserbad abgekühlt. Nach kurzer intensiver Durchmischung der Lymphozytensuspension mit der PBS/Agar-Lösung wurde die Mischung auf dem vorbereiteten Objektträger mit einer Pipette möglichst blasenfrei verteilt. Nach ca. 2–3 Min bei Raumtemperatur war der Agar fest. Die derart vorbereiteten Objektträger wurden anschließend für eine Stunde in 4 °C kalten Lysepuffer mit Zusatz von EDTA und TRITON (Lysepuffer(E,T)) in einer Kunststoffschale auf dem Eis inkubiert. Der Lysepuffer(E, T) wurde unmittelbar vorher aus 1 Teil EDTA-Lösung (9,3 g Na-EDTA [Fa.

SIGMA-Aldrich], 1,22 g NaOH [Fa. SIGMA-Aldrich], 20 ml H2O), 1 Teil TRITON (1%-ig Triton X100 [Fa. SIGMA-Aldrich] in H2O) und 8 Teilen Lysepuffer (14,6 g NaCl + 0,121 g Tris [Fa. SIGMA-Aldrich] + 0,79 g NaOH + 100 ml H₂O ) mit einem pH-Wert von exakt 10,0 hergestellt, die jeweils im Kühlschrank bei 4 °C gelagert wurden. Nach der Lyse wurde die nun frei im Gel vorliegende und entspiralisierte DNA im alkalischen Elektrophoresepuffer (pH-Wert: 13,0; 12,0 g NaOH + 0,35 g Na-EDTA, ad 1000 ml H₂O) durch Einlegen der Objektträger in eine horizontale Elektrophoresekammer (Fa. Biorad, München) und bei einer Spannung von 30 V und 300 mA 15 Min lang im Elektrophoresegerät LKB-GPS 200/400 (Fa.

Pharmacia^®, Freiburg) in Richtung der Anode angezogen.

Im elektrischen Feld wandern DNA-Fragmente, welche durch Einfach- oder Doppelstrangbrüche der DNA entstanden sind, aus dem Kern. Ungeschädigte DNA dagegen verbleibt innerhalb des Kernes. Das bei DNA-Schäden entstandene Bild gleicht einem Kometen, daher der Name “Komet-Test”.

Am Ende der Elektrophorese wurden die Objektträger eine Stunde lang in destilliertem Wasser „neutralisiert“ und gewaschen. Um falsche Ergebnisse zu vermeiden, wurden alle Arbeitsschritte mit den Proben unter strenger Temperaturkontrolle (0 bis 4°C) durchgeführt, da eine Temperaturerhöhung auch die DNA-Migration steigert (SPEIT et al., 1999). Um Schäden durch UV-Licht zu verhindern, erfolgte die Aufarbeitung der ungeschützten Lymphozyten in einer Dunkelkammer (SINGH et al., 1988). Anschließend wurden die Objektträger luftgetrocknet. Die luftgetrockneten Objektträger konnten bis zur Anfärbung bei Raumtemperatur in trockener Umgebung aufbewahrt werden. Nach Anfärben der DNA mit

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Fluoreszenzfarbstoff konnte anhand der Länge und Intensität des Schweifes das Ausmaß der DNA-Schädigung ermittelt werden. In dieser Studie wurde die klassische optische Zählung, Erkennung und Klassifikation der DNA und der Kometen mit den Schädigungsgraden 1–3 (Abb. 2) als Auswertung vorgenommen.

0 2

1 3

Abb. 2: Beispiele für optische Auswertung der geschädigten Lymphozyten DNA bei Hunden im Komet-Test (0=intakte DNA, Grade der Schädigung: 1<2<3)

3.6 Antioxidative Kapazität

Die AOK des Plasmas wurde in der vorliegenden Studie über das Prinzip bestimmt, den oxidativen Prozess durch Provokation mit dem Stressor H2O2 darzustellen. Als Marker dieses Prozesses diente der Fluoreszenzfarbstoff Dichlorofluorescindiacetat (DCFDA) (LeBEL et al., 1992). Dichlorofluorescindiacetat-H2 liegt in der reduzierten Form farblos sowie nicht fluoreszierend vor. Erst durch Oxidation kann sich der Fluoreszenzfarbstoff DCFDA entwickeln und zeigt damit das Fortschreiten der Oxidation bzw. eine verzögerte Oxidation durch die in den Proben vorhandenen antioxidativ wirkenden Inhaltstoffe im Testsystem an.

Der Testansatz wurde während der gesamten Messung in einem auf 25 °C temperierten Küvettenhalter gehalten. Halbmikro-Quarzküvetten wurden zunächst mit 800 µl NaCl-Tris-Puffer (pH-Wert: 7,4, 150 mmol/l NaCl, 20 mmol/l Trishydroxymethylaminomethan) und 100 µl DCFDA-H₂-Lösung (1:1000 verdünnt mit Reinst-Wasser) beschickt und im Küvettenhalter temperiert. Nach 5 Min wurden 50 µl Plasmaprobe (entsprechend 15 µg Protein; die Verdünnung der Plasmaprobe auf diese Proteinmenge mit dem Testpuffer erfolgte unter Berücksichtigung der Proteindaten aus der klinischen Laboranalytik) und zum Starten der Reaktion 50 µl H2O2 (30%-iges Konzentrat, 1:100 in Testpuffer verdünnt) zum Testansatz

56

pipettiert und mit einem Spatel gemischt. Nach weiteren 5 Min wurde in einminütigen Abständen die ansteigende relative Fluoreszenz im Fluorophotometer ermittelt. Am Fluorometer wurden folgende Einstellung gewählt: Ex: 488 nm, Em: 533 nm, Verstärkung: 5.

Der an jedem Messtag ermittelte maximale Anstieg der Fluoreszenz als Referenzwert konnte durch Zugabe von Testpuffer anstelle der Plasmaprobe dargestellt werden.

Berechnung:

Die Datenreihe der relativen Fluoreszenz jedes Plasmaprobenansatzes wurde in einem Diagramm gegenüber der Zeit (Minuten) aufgetragen. Der Anstieg der relativen Fluoreszenz zwischen der 9. und 15. Min konnte als lineare Gleichung mit einer stetigen Steigung (r² ≥ 0,98) ermittelt werden (Abb. 3). Die maximale Steigung wurde der verminderten Steigung der Proben als Prozentanteil gegenübergestellt und die antioxidative Kapazität nach folgender Formel berechnet:

Steigung _Probe × 100 Antioxidative Kapazität (%) = 100 - __________________________

Steigung _Max.

Abb. 3: Beispielhaftes Diagramm für die Ermittlung der Steigung für die Errechnung der antioxidativen Kapazität (100 - [(17,4/24,6) x 100] = 29,3%).

Steigung max a=24,6; r²=0,99 Steigung Probe a=17,4; r²=0,99

6 9 12 15 Minuten

200

150

100

50

0

relative Fluoreszenz

57 3.7 Nicht-veresterte Fettsäuren

Die Analytik der nicht-veresterten Fettsäuren im Plasma beruht auf der Grundlage der von ITAYA (1977) entwickelten Methode. Hierbei werden die freien Fettsäuren als Kupferseifen in eine Chloroformphase extrahiert und nach Zugabe eines spezifischen Farbstoffes in einem Spektralphotometer detektiert.

Im ersten Schritt wurden die freien Fettsäuren in einem Milieu bei pH-Wert 7,0 in die Chloroformphase extrahiert. Hierzu wurden Glasröhrchen mit einem Teflon-beschichteten Schraubdeckel verwendet. Zu 100 µl Plasma oder Standardlösung 0,3 mmol/l (Palmitinsäure) bzw. 0,9%-ige NaCl-Lösung als Blindwert, wurden 500 µl Phosphatpuffer (0,5 mol/l, pH-Wert 7,0) und 500 µl 0,9%-ige NaCl-Lösung gegeben und kurz gemischt. Nach Zugabe von 4,0 ml Chloroform wurden die Probenansätze 20 Min in einem Überkopfschüttler gemischt.

Eine Zentrifugation für 15 Min bei 3000 x g separierte die beiden Phasen, sodass die obere wässrige Phase mit Hilfe einer Pasteurpipette abgesaugt werden konnte.

Im zweiten Schritt wurden 2,0 ml einer täglich frisch angesetzten Kupfer-Triethanolamin-Essigsäure-Lösung (10 Teile 6,45%-ige Cu[NO₃]₂ + 9 Teile 1 mol/l Triethanolaminlösung + ein Teil 1 mol/l Essigsäure) jedem Ansatz zugesetzt, sodass die in der Chloroformphase befindlichen Fettsäuren in der anschließenden 30-minütigen Schüttelzeit im Überkopfschüttler Kupferseifen ausbilden konnten. Nach einer Zentrifugation für 15 Min bei 3000 x g konnte die obere Kupferphase abgesaugt werden.

2,0 ml der Chloroformphase wurden im letzten Schritt in einem neuen Glasröhrchen mit 750 µl des Farbreagenzes (19 Teile 0,5%-ige ethanolische Diphenylcarbazid-Lösung + 1 Teil 0,5%-ige ethanolische Diphenylcarbazon-Lösung) versetzt, gemischt und innerhalb der folgenden 30 Min im Spektralphotometer (Ultrospec III, LKB-Pharmacia, Bromma, Schweden) bei 546 nm vermessen. Alle Ansätze wurden als Doppelbestimmung durchgeführt.

58 Auswertung:

Zur Ermittlung der NEFA-Konzentration in den Plasmaproben wurde ein Standard mit Palmitinsäure als Referenzfettsäure jeweils im Parallelansatz mitgeführt. Ein Ansatz mit 0,9%-iger NaCl-Lösung anstelle der Plasmaprobe diente als Blindwert und konnte zur Nulleichung am Spektralphotometer eingesetzt werden. Die Berechnung folgte einer linearen Berechnungsformel:

ExtPr × CSt

______________

= CPr

ExtSt

ExtPr = Extinktion (546nm) der Probe ExtSt = Extinktion (546nm) des Standards

CPr = Konzentration der nicht-veresterter Fettsäuren der Leberprobe (mmol/l) CSt = Konzentration des Standards (mmol Fettsäure/l)

Im Dokument Untersuchungen zum oxidativen Stress beim Hund unter besonderer Berücksichtigung der Lebererkrankungen (Seite 54-66)