2.5 Ausgewählte analytische Methoden zur Untersuchung des oxidativen Stresses und der Lipidperoxidation
2.5.3 Antioxidative Kapazität
Die Bestimmung der AOK im Blutplasma oder -serum stellt ein Verfahren zur Erfassung der Leistung sowohl des enzymatischen als auch des nicht-enzymatischen antioxidativen Schutzsystems des Blutes dar (HETYEY et al., 2007). Über die Bestimmung der AOK wird die Fähigkeit des untersuchten Materials angegeben, mit freien Radikalen zu reagieren und diese zu neutralisieren. In der Praxis finden derzeit mehrere verschiedene Messmethoden der
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AOK Anwendung. Hierzu zählen z.B. die Sauerstoff-Radikale Absorptions-Kapazität (engl.:
oxygen radical absorbance capacity, [ORAC]), die vor allem als Messgröße für wasserlösliche Vitamine der antioxidativen Abwehr eingesetzt wird (CALDWELL, 2000), die Trolox-äquivalente antioxidative Kapazität (engl.: trolox equivalent antioxidative capacity [TEAC]), die wasser- und fettlösliche Antioxidantien erfasst (DALGIC et al., 2005), die gesamte Radikal-fangende antioxidative Kapazität (engl.: total radical trapping antioxidant parameter [TRAP], HALLIWELL und GUTTERIDGE, 1990; STOWE et al., 2006), die Eisen-reduzierende Eigenschaft des Plasmas (engl.: ferric reducing ability of plasma [FRAP], HETYEY et al., 2007), und die „totale antioxidative Kapazität“ mit dem Substrat 2,2,-Azino-di-3-Ethylbenzthiazolin-6-Sulphonat (ABTS) (engl.: total antioxidative capacity [TAC], NEMEC et al., 2000; HETYEY et al., 2007).
In einem Teil der Studien ermitteln Autoren die antioxidative Kapazität als Summe der Konzentrationen einzelner antioxidativer Substanzen (FREI et al., 1989; METE et al., 1999;
KUMARAGURUPARAN et al., 2002, 2002a; SARICAM et al., 2005; CEMEK et al., 2006;
CZECZOT et al., 2006; DEMORI et al., 2006; MANSOUR et al., 2006; OSMAN et al., 2007). Hierbei werden unterschiedliche Kombinationen antioxidativer Substanzen verwendet, wie z.B. Vitamin C, Harnsäure und Bilirubin (FREI et al., 1989), die Vitamine E und C in Kombination mit Katalase, Glutathion und Glutathion-Peroxidase (METE et al., 1999), SOD, Glutathion, Glutathione-Peroxidase und Glutathion-Reduktase (OSMAN et al., 2007); SOD, Katalase, reduziertes Glutathion, Glutathion-Peroxidase, Glutathion-Transferase, Vitamin E und C (KUMARAGURUPARAN et al., 2002a), reduziertes Glutathion, Beta-Karotin, Retinol, Vitamine E und C (CEMEK et al., 2006), Selen-unabhängige Glutathion-Peroxidase, Selen-abhängige Glutathion-Peroxidase, Glutathion-Transferase und Glutathion-Reduktase (CZECZOT et al., 2006), SOD, Glutathion, Glutathion-Peroxidase und Albumin (MANSOUR et al., 2006).
36 3 MATERIAL und METHODEN
3.1 Versuchsplan
Als Kontrollgruppe wurden Hunde, die klinisch gesund (Gruppe A, n=32) waren, verwendet.
Um die Fettstoffwechselstörungen der leberkranken Hunde festzustellen, wurden Plasmaproben und isolierte Lymphozyten leberkranker Hunde (Gruppe B, n=29) mit histologisch verifizierter Erkrankung in diese Studie einbezogen. Um die Messdaten auch anderen Krankheitsbildern gegenüberstellen zu können, wurden zwei weitere Probandengruppen gebildet: Hunde mit mindestens 12 Wochen altem Kreuzbandriss (Gruppe C, n=8) und Hunde mit verschiedenen Weichteilerkrankungen einschließlich z.B.
Gehirntumoren, Prostatitis u.a. (Gruppe D, n=9). Da die Entnahme der aureichenden Menge an Lebergewebe nur in Vollnarkose erfolgen konnte, wurde zudem der Einfluss der Narkose auf die Testergebnisse der untersuchten Messgrößen im Plasma bei 20 gesunden und 7 kranken Hunden (vier Hunde mit Kreuzbandriss, drei mit Weichteilerkrankung) studiert.
Hierzu erfolgten Probenentnahmen und Messungen vor und nach einer Stunde Inhalationsnarkose mit Isofluran (Einleitung der Narkose mit 1 mg/kg Diazepam [Diazepam-Ratiopharm Injektionlösung, Fa. Merckle GmbH, Blaubeuren] und 0,5 bis 1,0 mg/kg L-Polamivet [Levomethadon und Fenpipramid, Fa. Hoechst Roussel Vet. Unterschleißheim]).
Die zusätzliche Entnahme von Leberproben in Narkose erfolgte bei 21 leberkranken Hunden, während jedoch die Blutprobenentnahme bei diesen Patienten stets vor der Narkose durchgeführt wurde.
Aus Blutplasmaproben wurden jeweils folgende Messgrößen des oxidativen Stresses untersucht: MDA Messungen (mit HPLC und TBARS) und AOK. Zur weiteren Charakterisierung des Krankheitszustandes der Hunde wurden weitere hämatologische und klinisch-chemische Messungen durchgeführt: die antioxidativen Abwehr-Substanzen des Plasmas wie Bilirubin, Harnsäure und Albumin, die Lipid-Substanzen des Plasmas wie NEFA, Cholesterin und Triglyzeride, die Leberenzyme Alaninaminotransferase (ALT), Glutamatdehydrogenase (GLDH), Alkalische Phosphatase (AP) und zusätzlich Leukozytenzahl, Hämoglobin, Hämotokrit und Gesamteiweiß. Bei den leberkranken Hunden wurde zudem auch die Konzentration von MDA im Lebergewebe mit HPLC und TBARS
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gemessen. Bei einem Teil der Patienten (Gruppe A: 32, Gruppe B: 13, Gruppe C: 8, Gruppe D. 9) wurden aus EDTA-Blut Lymphozyten isoliert, die mittels Komet-Test auf ihren DNA-Schädigungsgrad hin untersucht wurden. Weiterhin wurden einige methodische Aspekte beim Komet-Test bearbeitet: Bei 9 gesunden Hunden wurde der Einfluss einer 60-minütigen Lagerung der Blutproben auf Eis auf das Messergebnis des Komet-Tests untersucht sowie bei 10 gesunden Hunden neben der 15-minütigen Elektrophorese auch eine 20-minütige Elektrophorese zum Vergleich durchgeführt. Bei 32 Patienten wurde die Zusammensetzung bzw. Reinheit der „Lymphozytenfraktion“ untersucht, um deren Einfluss auf das Komet-Test- Ergebnis zu erarbeiten.
Der Tierversuch wurde vom Niedersächischen Landesamt für Verbraucherschutz genehmigt (Aktenzeichen: 03A 174).
3.2 Tiere
Diese Studie wurde an Hunden durchgeführt, die entweder im Besitz der Klinik waren oder aus dem Patientenaufkommen der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover ausgewählt wurden. Rasse, Alter oder Geschlecht wurden dabei nicht berücksichtigt.
Gruppe A (gesunde Kontrolle)
Unter den gesunden Hunden der Kontrollgruppe befanden sich neben klinisch gesunden Klinikpatienten verschiedener Rassen, die aus unterschiedlichen Gründen in der Klinik vorgestellt wurden, auch 10 klinikeigene Beagles, die in der Klinik für Kleintiere als Blutspendetiere gehalten werden (Tabelle 7). Die Tiere waren im Median 2,3 Jahre alt (Minimum: 1 Jahre, Maximum: 7,2 Jahre). 13 Hunde waren männlich unkastriert, 4 Hunde waren männliche kastrierte Tiere, 13 Hunde waren weiblich unkastriert und 2 Hunde waren weiblich kastriert. Es wurden nur Tiere berücksichtigt, bei denen die Anamnese keinen Hinweis auf eine Erkrankung ergab und auch bei der klinischen Allgemeinuntersuchung kein abweichender Befund erhoben werden konnte. Auch ein hämatologisches und blutchemisches Profil zeigte bei keinem der Tiere einen abweichenden Befund.
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Tabelle 7: Rasse, Geschlecht, Alter und der Grund des Klinikbesuches von 32 gesunden Hunden, die als Kontrollgruppe (Gruppe A; n=32) herangezogen wurden.
Tiernummer Rasse Geschlecht
Alter (Jahre, Monate)
Grund des Besuchs
28 Beagle Mk 2,0 Klinikeigen
34 Beagle Wk 2,0 Klinikeigen
37 Beagle Wk 2,3 Klinikeigen
38 Beagle Mk 4,4 Klinikeigen
39 Beagle M 2,0 Klinikeigen
40 Beagle Mk 2,0 Klinikeigen
41 Beagle W 4,4 Klinikeigen
42 Beagle Mk 2,0 Klinikeigen
47 Weimaraner M 1,3 Implantatentfernung
49 Mischling M 7,2 Implantatentfernung
50 Deutscher Schäferhund M 2,2 HD-Untersuchung
51 Bullterrier W 4,1 Kastration
52 Labrador M 1,5 HD-Untersuchung
53 Cattle dog M 1,6 HD-Untersuchung
55 Dogge W 1,2 Kastration
56 Retriever M 1,5 HD-Untersuchung
57 Beagle W 1,5 Klinikeigen
58 Beagle W 1,5 Klinikeigen
60 Entlebucher Sennenhund W 1,1 HD-Untersuchung
61 Mischling W 3,1 Kastration
62 Retriever M 1,6 HD-Untersuchung
65 Islandhund W 1,6 HD-Untersuchung
66 Beagle M 2,6 Kastration
68 Belgischer Schäferhund M 2,0 HD-Untersuchung
69 Deutsch Langhaar M 1,0 HD-Untersuchung
70 Hovawart W 1,5 HD-Untersuchung
71 Bracke W 1,0 Entropium
73 Mischling W 2,8 HD-Untersuchung
74 Leonberger W 2,3 HD-Untersuchung
76 Dobermann M 1,1 HD-Untersuchung
79 Retriever M 1,0 HD-Untersuchung
81 Mischling W 6,1 Kastration
W: weiblich, M: männlich, Wk: weiblich kastriert, Mk: Männlich kastriert, A: Alter des Tiers, HD: Hüftgelenksdysplasie
39 Gruppe B (leberkranke Hunde)
Unter den 29 leberkranken Hunden der Studie befanden sich verschiedene Erkrankungen (Tabelle 8). Die Tiere waren im Median 7,8 Jahre alt (Minimum: 1,2 Jahre, Maximum: 13 Jahre). 13 Hunde waren männlich unkastriert, ein Hund war männlich kastriert, 11 Hunde waren weiblich unkastriert und 5 Hunde weiblich kastriert. Histopathologische Diagnosen lagen von 25 Hunden vor, wovon 21 auf konventionellen Biopsien und 4 auf True Cut-Biopsien beruhten (Tabelle 8). Bei weiteren 4 Hunden basierte die feingewebliche Diagnose auf Feinnadelaspiraten. Die Tiere mit feingeweblichen Befunden wurden in die Untergruppen degenerative Hepatopathie (n=16), Neoplasie der Leber (n=3), entzündliche Hepatopathie (n=5) und sonstige Hepatopathie (n=5) eingeteilt. Ein Hund (Tiernummer 83), bei dem in Verbindung mit der Zytologie nur eine Verdachtsdiagnose (Leberzirrhose) gestellt werden konnte, wurde in die Gruppe der sonstigen Hepatopathien eingeteilt. Tru Cut-Biopsien und Feinnadelaspirate wurden unter sonographischer Kontrolle entnommen.
Bei 21 der Hunde konnte ausreichend Lebergewebe entnommen werden, um auch Bestimmungen von Messgrößen des oxidativen Stresses im Lebergewebe durchzuführen, da die Tiere anschließend wegen infauster Prognose eingeschläfert werden mussten.
Tabelle 8 (Seite: 40): Tiernummer (TN), Rasse, Geschlecht, Alter, Art und Ergebnis der feingeweblichen Untersuchung bei 29 leberkranken Hunden, die in der vorliegenden Arbeit als Gruppe B gruppiert wurden.
40
Mgr. periportale und interlobuläre Fibrosierung;
ggr. Gallengangsproliferation; fokale, granulomatöse, eosinophile Hepatitis; mgr.
Pigmentspeicherung; mgr. periportal akzentuierte, gemischtzellige Hepatitis unter Beteiligung eosinophiler Granulozyten. (s.O:
hgr. granulomatöse eosinophile Gastritis) 2
T* Mischling M 4,11 + Unreifzelliges malignes Lymphom in der Leber
(s.O: dito in Milz und Lymphknoten)
3
D* Kromfohrländer W 11,6 +
Prominente periportale und zentrolobuläre Fibrose mit Gallengangshyperplasie, mäßige lymphoplasmazelluläre, teils histiozytäre Entzündungszellinfiltration, Cholestase, großflächige, gemischttropfige Verfettung der Hepatozyten
4
S* Mischling Mk 3,3 +
Subakute bis chronische Stauungsleber mit gering- bis mgr. Perihepatitis und zahlreichen Lymphangiektasien
5
D* Mischling M 7,2 +
Multifokale, gering- bis mgr. periportale Fibrose, ggr. Gallengangsproliferation, mgr.
Kupfferzellsiderose, mgr. Itozellhyperplasie (s.O: hgr., granulomatöse Enzephalitis)
6
D* Mischling M 7,1 +
Hgr. panlobuläre Hepatose mit feintropfiger Verfettung, Glykogenspeicherung, zahlreiche solitäre oder nesterartige, hepatozelluläre Nekrosen
(s.O: Mittel- bis hgr. Eitrig-nekrotisierende Pankreatitis mit perifokaler, eitrig- nekrotisierender Steatitis)
8
D* Deutsch Kurzhaar M 6,10 +
Mgr. periportale Fibrose, herdförmig ggr. Eitrige Hepatitis (s.O: Rektum: gut differenziertes, lokal invasiv wachsendes Adenokarzinom mit multifokaler Lymphangiosis carcinomatosa)
9
D* Münsterländer M 10 +
Cholestase, gering- bis mgr. Zentrolobuläre Nekosen, aktivierte Kupffersche Sternzellen, mgr. Kupfferzellhämosiderose, ggr.
hepatozelluläre Regeneration mit Mitosen. An der Spitze des linken Leberlappens fokaler Substanzverlust mit adhärentem koagulierten Blut (s.O: Tierkörper: hgr. Ikterus)
10 E*
Rhodesian
Ridgeback M 5 +
Akute Stauung; akute bis subakute, ggr. bis mgr.
eitrige Pericholangitis; einzelne Mikroabzesse (s.O: Niere: infiltrativ wachsendes, malignes Lymphom. Magen, Milz: malignes Lymphom) 11
T* Mischling W 11,9 + Infiltrativ wachsende histiozytäre Neoplasie D: degenerativ, E: entzündlich, T: Tumor, S: sonstiges, W: weiblich, M: männlich, Wk: weiblich kastriert, Mk: männlich kastriert, F: FNA: Feinnadelaspiration, ggr: geringgradig, mgr: mittelgradig, hgr: hochgradig, A: Alter des Tiers, P:
Pathologische Bericht, *: Lebergewebe Messung, L: Leber T: Tru Cut, s.O: sonstige Organdiagnosen
41
Tabelle 8 (Forts.): Tiernummer (TN), Rasse, Geschlecht, Alter, Art und Ergebnis der feingeweblichen Untersuchung bei 29 leberkranken Hunden.
TN Rasse Geschlecht
Arterialisierung der periportalen Felder, ggr.
periportale Lymphangiektasien, mgr.
hepatozelluläre Glykogenspeicherung, portosystemische Shunts (s.O: Niere und Lymphknoten: unreifzelliges malignes Lymphom)
14
D* Cocker Spaniel M 9 +
Mäßige, diffuse Itozellhyperplasie, herdförmige Kupfferzellhyperplasie mit ggr.
Pigmentspeicherungen, hydropische Beschaffenheit der Hepatozyten, herdförmig ggr. Infiltration mit neutrohilen Granulozyten, ggr- bis mgr. periportale lympho-histiozytäre Infiltration.
(s.O: Magen: infiltrativ wachsendes Karzinom.
Lymphknoten: Karzinommetastase) 15
E Retriever W 3,6 +T Multifokale, fibrinös-eitrig nekrotisierende Hepatitis (s.O: Myocarditis., Splenitis)
16
D* Mischling Wk 12,5 +
Mäßig diffuse Itozellhyperplasie, ggr. herdförmig ballonierende, teils auch hydropische Degeneration der Hepatozyten und fokal mäßige Kupfferzellhyperplasie mit Hämosiderose. (s.O:
eitrig- ulzerative Gastritis) 21
D*
Staffordshire-
Terrier M 13 +
Multifokale, vakuolige Beschaffenheit der Hepatozyten, vereinzelte Degeneration von Hepatozyten. Gallenkapillarthromben, vereinzelter Gallenstau in größeren Gallengängen, ggr.
gemischtzellige Pericholangitis. (s.O: Prostatitis) 22
E* Dobermann W 5,11 +
Ggr. diffuse granulozytäre und ggr. lymphozytäre interstitielle Hepatitis, ggr. periportale Hämosiderose, ggr. Aktivierung der Kupfferschen Sternzellen, ggr. diffuse hepatozelluläre Pigmentspeicherung. (s.O: Serom/Hämatom mit Granulationsgewebe im Beckenbereich)
24
T* Retriever W 10 +
Lokal invasiv wachsendes cholangiogenes Karzinom mit Nekrosen und Einbruch in venöse Gefäße. (s.O: Lunge: Metastasen eines tubulären Karzinoms, hgr. eitrige Leptomeningitis)
27
D Münsterländer M 12,1 +T
Mäßige, gemischttropfige Verfettung mit Einzelzellnekrosen, vermehrter Gehalt an neutrophilen Granulozyten in den Sinusoiden, gelb-braune Pigmentablagerungen in den Hepatozyten.
(s.O: Ikterus)
D: degenerativ, E: entzündlich, T: Tumor, S: sonstiges, W: weiblich, M: männlich, Wk: weiblich kastriert, Mk: männlich kastriert, F: FNA: Feinnadelaspiration, ggr: geringgradig, mgr: mittelgradig, hgr: hochgradig, A: Alter des Tiers, P:
Pathologische Bericht, *: Lebergewebe Messung, L: Leber T: Tru Cut, s.O: sonstige Organdiagnosen
42
Tabelle 8 (Forts.): Tiernummer (TN), Rasse, Geschlecht, Alter, Art und Ergebnis der feingeweblichen Untersuchung bei 29 leberkranken Hunden.
TN Rasse Geschlecht
Porto-systemischer Shunt mit Perfusionsstörung, zahlreiche periportale Felder mit deutlicher Arteriolisierung, hgr. Lymphangiektasien, mgr.
Fibrose, multifokal Fehlen der periportalen Venen;
multifokal Nachweis einer ggr. bis mgr. granulo-histiozytären Hepatitis mit hepatozellulären Untergängen, mgr. Gallengangsproliferation und hepatozelluläre, hydropische bis fettige Degeneration der Sinusoide
35
Mgr. diffuse Cholestase; fokale, chronische, fibrosierende und granulomatöse pendulierende Perihepatitis mit zentraler dystrophischer Verkalkung (s.O: infiltrativ wachsendes Mesotheliom mit großflächigen Nekrosen an der Niere)
75
S* Mischling W 1,2 +
Mgr. Lymphangiektasie. (s.O: Aszites, Gastritis, Proteinverlust-Enteropathie)
77
D* Retriever Wk 10 +F
Multifokal mgr. Hämosiderose, ggr.
Glycogenspeicherung. (s.O: Pankreas: Lokal invasiv wachsendes Inselkarzinom mit Gefäßeinbrüchen, Milz: mgr. Hyperämie, Hämosiderose, subkapsuläre Fettgewebsinfiltration) FNA: mgr Leberdegeneration, Cholestase
78
D* Labrador Wk 8 +
Mgr. Glykogenspeicherung, multifokale herdförmig hepatozelluläre braune Pigmentablagerung
(s.O: Duodenum und Pankreas: infiltrativ wachsendes, histiozytäres Sarkom mit hämatogener Metastasierung)
80
D Pon Wk 10,7 F FNA: moderate nicht fettige Degeneration
83
S Mischling W 12,8 F
FNA: Leberzelldegeneration, V.a. Zirrhose, (sonographisch: Läsionen in allen Leberlappen).
(s.O: Aszites, Liquidothorax) 84
D* Mischling M 8 +F
Multiple Periportalfelder mit prominenter Fibrose, einzelne nekrotische Zellen, Anisokaryose der Hepatozyten, FNA: mgr. Leberverfettung, sehr viel Bindegewebe, Zirrhose/ Fibrose Lebergewebe ohne Anzeichen auf Malignität, (s.O: Milz: ggr. diffuse eitrige Entzündung) (s.O: Aszites)
85 S
Berner
Sennenhund M 8,11 F
FNA: mgr. nicht fettige Degeneration, Hepatitis (hgr. Gehalt an Lymphozyten und neuthrophilen Granulozyten) (s.O: FNA Milz: Hyperplasie, extramedulläre Hämatopoese)
D: degenerativ, E: entzündlich, T: Tumor, S: sonstiges, W: weiblich, M: männlich, Wk: weiblich kastriert, Mk: männlich kastriert, F: FNA: Feinnadelaspiration, ggr: geringgradig, mgr: mittelgradig, hgr: hochgradig, A: Alter des Tiers, P:
Pathologische Bericht, *: Lebergewebe Messung, L: Leber T: Tru Cut, s.O: sonstige Organdiagnosen
43 Gruppe C (Hunde mit Kreuzbandriss)
Als Gruppe C wurden acht Hunde mit Kreuzbandriss zusammengefasst, die in der Klinik für Kleintiere als Patient vorgestellt wurden (Tabelle 9). Diese Hunde waren im Median 5,7 Jahre alt (Minimum: 2,1 Jahre alt, Maximum: 10 Jahre). 3 Hunde waren männlich unkastriert, ein Hund war männlich kastriert, 4 Hunde waren weiblich unkastriert.
Tabelle 9: Tiernummer, Rasse, Geschlecht und Alter von 8 Hunden mit Kreuzbandriss, die als Patientengruppe (Gruppe C) herangezogen wurden.
W: weiblich, M: männlich, Mk: männlich kastriert, A: Alter des Tieres
Tiernummer Rasse Geschlecht Alter
(Jahre, Monate)
20 Mischling M 8,8
29 Boxer M 5,0
32 Rottweiler M 7,0
48 Retriever Mk 3,6
54 Rottweiler W 5,3
59 Deutscher Schäferhund W 6,3
72 Dobermann W 7,0
82 Boxer W 4,8
44 Gruppe D (Weichteilerkrankungen)
Unter den Hunden dieser Studie, die in die Gruppe mit Weichteilerkrankungen zusammengefasst wurden, befanden sich ganz unterschiedliche Erkrankungen (Tabelle 10).
Die Tiere waren im Median 7,6 Jahre (Minimum: 1,8 Jahre, Maximum: 13,5 Jahre). Vier Hunde waren männlich unkastriert, drei Hunde waren männliche, kastrierte Tiere, ein Tier war weiblich unkastriert und ein Weiteres war weiblich kastriert.
Tabelle 10: Tiernummer (TN), Rasse, Geschlecht, Alter und der Grund des Klinikbesuches von 9 Hunden mit Weichteilerkrankungen, die als Patientengruppe D herangezogen wurden.
TN Rasse Geschlecht
Alter (Jahre, Monate)
Diagnose
7 Boxer M 6,3 Chronische Prostatitis mit paraprostatischen Zyste.,Mastzelltumor (im Skrotum)
12 Berner
Sennenhund W 8,11 Pyometra
17 Boxer W 9,6 Intrakranieller Tumor (Magnetresonanztomografie, keine histologische Differenzierung)
18 Rhodesian
Ridgeback M 6,9 Othämatom, (benignes) kutanes Melanom im Zwischenzehenbereich
19 Mischling Mk 9,0 Lungentumor (Computertomografie, keine histologische Differenzierung)
45 Schnauzer Wk 1,8 V.a. idiopatische Epilepsie
46 Mischling Mk 13,5 Adenom der Meibomschen Drüsen
63 Rhodesian
Ridgeback Mk 10,0 Perinealhernie
64 Hovawart M 12,4 Adenokarzinom Magen mit
Lymphknotenmetastasen W: weiblich, M: männlich, Wk: weiblich kastriert, Mk: männlich kastriert, V.a.: Verdacht auf
45 3.3 Probengewinnung