3. Vorstellung der Teilprojekte (Σύνοψη)
3.1 Markierung von 3-Acyltetramsäuren
3.1.3 Synthese verschiedener terminaler Alkine für Klick- Markierung
Dann habe ich als nächstes eine oben bereits angesprochene alkinterminierte Seiten-kette dargestellt42 (Abb.36). Dabei zeigte sich, dass die geplanten Reaktionen alle in guter Ausbeute abliefen, wobei die Intermediate leicht zu reinigen waren.
Ausgehend von den billigen Hexandiol 98a und Dodecandiol 98b wurde jeweils monobromiert43 und THP- geschützt. Das Alkin wurde als leicht handhabbarer Lithium-acetylid-Ethylendiaminkomplex in sehr guten Ausbeuten eingeführt. Nach der Frei-setzung des Alkoholes 102 wurde dieser für die 3-Acylierung von Tetram- und Thiotetronsäuren zur Säure44 103 oder für die Wittigreaktion mit den entsprechenden 3-Acyl-Yliden zum Aldeyd 104 oxydiert. Für die HWE- Reaktion (Abb.37) wurden die Alkine problemlos TMS-geschützt45. Die Desilylierung der fertigen 3-Acyltetramsäure verlief schnell und einfach mit TBAF; in der analytischen HPLC bei den üblichen 70-100% Methanol mit 0.1% Ameisensäure im Wasseranteil fand bereits vollständige Enschützung während des Laufes statt.
OH
Abb.36: Synthese von diversen Alkin-terminierten aliphatischen Säuren und Aldehyden ausgehend von Pentandiol 98a Hexandiol 98b und Dodecandiol 98b, inklusive TMS- geschützter Alkine
Während der Synthese der Derivate vom Sarcosin stellte sich heraus, dass sich das analoge Acylylid unter verschiedenen Bedingungen weder isolieren, noch mit dem sehr stabilen Anisaldehyd umsetzen ließ. Bei der Synthese von Raveninsäure46 hatte Andrea Schlenk aber genau das N-Boc Analog verwendet. Dies ist ein weiteres Beispiel für den großen Unterschied zwischen den N-methylierten und nicht N-methylierten Tetramsäuren. Da ich dennoch das entsprechende α,β- ungesättigte Alkinderivat für den Vergleich mit dem 5-Methyl-Analog
98a
37
darstellen wollte, griff ich ausnahmsweise einmal auf die Lacey-Dieckmann-Route47 zurück.
Auf diese Weise konnte schnell eine große Menge (fast 1g) der Zielverbindung gewonnen
1) Pyridin, DCM, 0°C, 1h 2) Toluol, reflux, 1h
Abb.37: Synthese von alkinterminierter 3-Acyltetramsäure 115 und lichtmikroskopische Aufnahmen von PtK2 –Zellen nach über-Nacht- Inkubation mit 115 (80(unten)- je20(oben) µg/mL) und in-situ- Fluoreszenzmarkierung über Klick- Reaktion zu 116, durchgeführt von Aruna Raja am Helmholtz- Zentrum für Infektionsforschung zu Braunschweig.
108c
38
Nachdem ich nun alle Bausteine fertiggestellt hatte, kombinierte ich diese zu der in Abb. 38 gezeigten Bibliothek. Dafür stellte ich die Tetramsäuren von Phenylalanin und Isoleucin über die Meldrumssäuremethode her und 115 wie oben beschrieben; alle anderen Heterozyklen wurden mit Ylid 43 erhalten.
N O
HO
O OH
N O
HO
O OH
N O
HO
O OH
Threo 2+12+2
Threo 12+2 Threo 2+5+2
N O O OH
Ala 2+12+2
N O O OH
N O
O OH
Ala 12+2 Sarc 2+12+2
OH
S O
O Thio 12+2
HN O
O OH
HN O
O OH
Phe 2+12+2
Ile 2+12+2 117
118
115
119
120c
120a
121
122
123 Anzahl Kohlenstoffatome: aus Ylid 43 + Diol 98 + Alkin
Abb.38: Alkinbibliothek verschiedener Heterozyklen mit unterschiedlich langen Seitenketten.
39
Katharina Mahal bestimmte von vier der obigen Alkine mittels MTT- Test (siehe Abb.25) zunächst die Zytotoxizität an Hautkrebszellen (Abb.39). Daran erkennt man nicht überraschenderweise, dass die Melophlin- ähnlichen Derivate zytotoxischer wirken, als die Penicillenol- ähnlichen. Natürlich wirken Substanzen mit langer hydrophober Seitenkette allein schon durch ihre Eigenschaft toxisch, mit der Seitenkette in Membranen zu
„interkalieren“ und somit diese zu destabilisierten. Ein solcher Effekt ist aber für Therapeutika unerwünscht, da er nicht zwischen gesunden und Krebszellen diskriminiert.
Weiterhin wirkt das apolare Alaninderivat 119 besser, als die polareren Derivate von Sarcosin 115 und Threonin 120.
Abb.39: IC50- Werte von 115, 119, 120c und 120a an 518A2- Zellen
Außerdem untersuchte Katharina Mahal die Verbindungen auf Unterschiede in durchflusszytometrische Zellzyklusanalysen, als auch Fluoreszenzfärbungen mittels Hyxdroxycoumarinazid (Abb. 40,41).
115 119 120c 120a
115, 119,
Abb.40: Zellzyklusanalysen der Melophlinanaloga 115/ 119 und lichtmikroskopische Aufnahmen mit 115/ 119 behandelter Zellen, markiert mit Hydroxycoumarinazid
40
Unterscheiden sich zwar 115/ 119 kaum in ihrer zellulären Verteilung und hinsichtlich der Beeinflussung des Zellzyklus‘, fällt deutlich der G2- Arrest der mit Penicillenol- derivat 120a behandelten Zellen ins Auge (Abb.41). Interessanterweise zeigen die mikroskopischen Aufnahmen genauso auffallend die Verteilung des langkettigeren 120c in granulösen Strukturen außerhalb des Zellkerns. Hierbei könnte es sich um den Golgi- Apparat, oder das endoplasmatische Reticulum handeln, was mittels Kolokalisation mit spezifischen, fluoreszenzmarkierten Antikörpern zu beweisen wäre. Im Kontrast dazu färbt das kurzkettigere 120a die Zellkerne und insbesondere die Nucleoli; die Beinflussung von Strukturen, die im Kern für die Organisation der Chromosomen zuständig sind, könnte das Eintreten in die Mitose verhindern und somit den G2- Arrest verursachen.
120c 120a
Abb.41: Zellzyklusanalysen der Penicillenolanaloga 120a/c und lichtmikroskopische Auf-nahmen mit 120a/c behandelter Zellen, markiert mit Hydroxycoumarinazid
41
Versuche zur Kolokalisation Alkin- markierter 3-Acyltetram-säuren mit spezifischen Antikörpern
Sebastian Schrüfer, Verena Fetz, Karl Kempf, Rainer Schobert; Publikation in Vorbereitung Colokalisation mit dsRED-fusionierten Proteinen
Hierfür habe ich die Alkinyl- Tetramsäuren von der Idee der Markierungsmethode bis zur Synthese und Isolierung hergestellt. An der biochemischen Anwendung habe ich nicht mitgewirkt.
Durchführung: alle Volumina 200 µL, wenn nicht anders angegeben
-KB 1.3-Zellen in „Chamberslides 15µ slides 8 well“ aussähen, 200 µL Volumen, Zelldichte 0,06* 106 Zellen/mL
-nach ca. 24 h Plasmid-Transfektion mit Jet-Prime-Transfection-Kit (30 µL Puffer, 0,3 µg Plasmid-DNA, 0,6 µL Transfektionsreagenz; Portionsweise Zugabe über die gesamte Fläche des wells)
-nach etwa 16 h erfolgte Zugabe der Tetramsäuren mit einer finalen Konzentration von 100 µM, Inkubationszeit 6 h,
-Zellen einmal mit PBS gewaschen und 15 min mit 4% Formaldehyd in PBS fixiert -Blockieren (1% BSA, 0,1% Triton X100 in PBS) für 20 min
-Zugabe des Click-Mastermix: 40 µL CuSO4 (100 mM)
100 µL Na-Ascorbat (100 mM, frisch) 20 µL Hydroxy-Coumarin (10 mM) 1840 µL 1% BSA in PBS
2 h im Dunkeln bei RT inkubiert
-Blockieren für 5 min mit 1% BSA in PBS und anschließend mit PBS überschichtet bis zur Mikroskopie
Ergebnisse:
a) 117 HN O
O OH
ER = endoplasmat. Retikulum, Mito = Mitochondrium
Das Fluoreszenzsignal der Tetramsäure 117 kolokalisierte teilweise mit fluoreszenzmarkierten ER- als auch Mitochondrien-Markerproteinen. Da kein eindeutiger
42 0
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
M1 M2 GPC
KK149 ER-dsRED KK149 Mito-dsRED
Unterschied in der Überlagerung mit ER oder Mitochondrien Signalen detektiert werden konnte, kann die intrazelluläre Lokalisation von 117 nicht eindeutig definiert werden. Das Einfügen einer Photoaffinitätsgruppe könnte eine genauere Lokalisierung der Tetramsäure innerhalb der Zelle ermöglichen.
Abbildung 1: Transfektion der KB 1-3-Zellen mit ER-dsRED und Mito-dsRed, anschließende Inkubation mit 117 und Click-Reaktion. Einzelfärbungen und Überlagerung der Einzelfärbungen
Abbildung 2: Bestimmung des Colokalisations-Koeffizienten ER-dsRED und Coumarin bzw. Mito-dsRED und Coumarin. M1/2 = Manders coefficient Channel 1/2, GPC = Pearson’s correlation coefficient.
ColocCoeff 117
117 117+
43 0
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
M1 M2 GPC
KK362 ER-dsRED KK362 Mito-dsRED
b) 119 N O
O OH
Für die Tetramsäure 119 zeigte sich ein ähnliches Bild wie für Verbindung 117. Auch hier konnte keine eindeutige Colokalisation der Verbindung im ER oder den Mitochondrien nachgewiesen werden (Abb. 3 und 4).
Abbildung 3: Transfektion der KB 1-3-Zellen mit ER-dsRED und Mito-dsRed, anschließende Inkubation mit 119 und Click-Reaktion. Einzelfärbungen und Überlagerung der Einzelfärbungen
Abbildung 4: Bestimmung des Colokalisations-Koeffizienten ER-dsRED und Coumarin bzw. Mito-dsRED und Coumarin
ColocCoeff
119 119 119+
44