Synthese von Bisazidderivaten für Photoaffinitätsmarkierung und Isolierung der Zielproteine

Zunächst versuchte ich, analog zur Synthese von Photovastatin⁴⁸, die Bisazideinheit über den Benzylalkohol 124 mit einer Seitenkette zu verethern.

Der nach Literaturvorschrift erhaltene 124 reagierte nicht mit kommerziell erhältlicher 10-Bromo-decansäure 125.

Abb.42: fehlgeschlagene Veretherung mit Alkylbromid

Tabelle 1: 124 reagierte unter folgenden Bedingungen auch nicht mit dem analogen 10-Bromo-decansäuremethylester.

Base Katalysator Kronenether LM

A NaH KJ - DMSO rückgebildet, weshalb mit dem 8- Hydroxyoctansäureethylester 126 ebenfalls keine Veretherung erfolgte.

Abb.43: fehlgeschlagene Veretherung mit Tosylchlorid a) NaH/DMF

45

Das bei der Synthese als Nebenprodukt erhaltene Azidobenzylbromid 127 war so inert, dass es nicht einmal nach tagelangem Kochen in THF Zersetzung zeigte, geschweige denn Veretherung.

Br

N₃ O

O

O O

OH

O

Br Br

N₃ THF, reflux, 3d

Abb.44: fehlgeschlagene Veretherung mit Benzylbromid

Nach so vielen Fehlversuchen verlief jedoch die Route zur analogen funktionalisierten Benzoësäure völlig problemlos. Die Amidbildung aus derselben und dem 11-Amino-undecansäuremethylester mit T3P überraschte sogar mit quantitativer Ausbeute und konnte somit publiziert werden (Abschnitt 4.3).

Nach derselben Methode habe ich dann noch zwei weitere Bisazidderivate dargestellt, welche von Katharina Mahal und Philipp Kahlen verwendet wurden, um die daran gebundenen Proteine isolieren zu können. Als Vortest konnte Katharina mittels Streptavidin-funktionalisierter Festphase die Bindung von BSA aus einer konzentrierten Lösung (1mg/mL) an diese Bisazide nach Photo-aktivierung und anschließender Staudinger- Ligation mit Biotin-Phosphin bestätigen.

OH

NH O

N₃

N₃

N O

HO O

OH

NH O

N₃

N₃

N O

O

OH

NH O

N₃

N₃ HN O

O

Abb.45: von mir dargestellte Bisazid- markierte Tetramsäurederivate

126 127

128

129

130

46

Die drei Derivate (128- 130) in einer Lösung aus Zelllysat wurden nach Belichtung mit 150 W mittels einer Staudinger- Ligation an ein Biotin- Phoshin 131 gebunden.

S HN NH

O

H H H

N O

O H

N

3 O

PPh₂ O O

Abb. 46: kommerziell von ThermoScientific erhältliches „EZ-Link^® Phosphine-PEG3-Biotin“

Nach einer Affinitätsaufreinigung mit magnetischen Streptavidin- Perlen lieferte das erste Gel keine sichtbaren Banden. Dies lag wahrscheinlich daran, dass vergessen wurde, den Wasserkühlmantel der Lampe zu entfernen. Dieser ist zwar unerlässlich, um bei längeren Reaktionen ein Überhitzen der Lampe zu verhindern, aber drei bis fünf Minuten sind auch ohne möglich. Meine Vorversuche zur Photoaktivierung des Bisazids hatten nämlich gezeigt, dass jene Glasschicht wohl das Licht niedriger UV- Wellenlängen herausfiltert, welches für diese Photoreaktion unerlässlich ist.

Bei dem zweiten Versuch wurden die Perlen weniger oft gewaschen, was dazu führte, dass auf dem Gel überall die Banden des Zelllysates zu sehen waren.

Außerdem mussten die Proben über Dialyse bzw. Mikro-Säulen vom Überschuss an Biotin- Phosphin befreit werden.

Weiterhin war nicht auszuschließen, dass das Zielprotein ein (mitochondriales) Membranprotein ist, welches durch die Zentrifugation des Zelllysats vor dem Experiment abgetrennt wurde.

Beim dritten Versuch wurden folgende Veränderungen vorgenommen:

 Vorabsättigung der Festphasenperlen mit Biotin- Phosphin, wodurch der Überschuss sofort abgetrennt wird und eine Dialyse entfällt

 Lyse zusätzlich zum TritonX-Detergens mit mechanischem Homogenisator, um Membranproteine besser in Lösung zu überführen

 Schwächere Zentrifugation (300g), um auch schwerere Protein(komplexe) im Experiment zu behalten

 Stringenteres Waschen, um unspezifisch gebundene Proteine zu entfernen

Leider war zu diesem Zeitpunkt noch kein Kontakt zu einer massenspektrometrischen Untersuchung hergestellt worden, weshalb dieses Gel verworfen und die restlichen Proben (weil nur ein Teil der Lösung aufgetragen wurde) eingefroren wurden. Als dann einige Monate später letztere Proben am Institut für Pflanzenbiochemie in Halle erneut gelchromatographisch untersucht wurden, zeigten sich keine spezifischen Banden. Obwohl

131

47

die Proteine vollständig denaturiert und so relativ stabilisiert gelagert wurden, kann es zur Zerstzung gekommen sein.

Abb. 47: das SDS- Polyacrylamid-Gel des dritten Versuchs. Man erkennt in den drei Proben der Bisazid- Tetramsäuren (128- 130) mehrere Proteinbanden, die in der Negativkontrolle nicht vorkommen. Die unspezifische Bande als „Ladekontrolle“ ist jedoch zu sehen. Bei Ansatz II wurde ein Wasch-Schritt vergessen, weshalb zu viele unspezifische Banden zu sehen sind.

Beim vierten Versuch, der analog zum dritten durchgeführt wurde, konnten obige Ergebnisse leider nicht reproduziert werden. Hier wiesen alle fünf Spuren dasselbe Bandemuster auf: die Negativkontrollen ohne Biotin-Phosphin bzw. ohne Tetramsäure ebenso wie die Eluate von den magnetischen Perlen mit den Bisazidtetramsäuren. Dies kann eine Folge ungenügenden Waschens sein, wenn zu viele unspezifisch gebundene Proteine die geringen Mengen spezifische Zielproteine überdecken. Genau dieser Effekt ist ja auch bei manchen der vorherigen Versuche schon aufgetreten.

Nur ganz unten zwischen 10- 15 kDA könnte man zwei Banden vermuten, welche aber nicht mit denen vom letzten Versuch übereinstimmen.

Beim nächsten Versuch muss also wieder auf stringentes Waschen geachtet werden!

MW

(kDa) ÄtOH 128 129 130 Zelllysat (zu schwach gewaschen) -

170 130 100 70 55

35 25 15

10

Ansatz II Ansatz I

unspez. Bande

48 Abb. 48: das SDS- Polyacrylamid-Gel des vierten Versuchs

3.2 3-Acylierung von Tetramsäuren mittels

Ketenyliden-triphenylphosphoran und Umsetzung der Ylide mit verschiedenen Oxokomponenten

Prinzipiell existierten bisher nur zwei Arten, eine Tetramsäure an Position 3 zu acylieren.

Setzt man die freie Tetramsäure 62 mit einer aktivierten Carbonsäure nach Yoshii⁴⁹ um, erhält man die analoge 4-O-Acyl-Tetramsäure, welche durch eine Fries- ähnliche Verschiebung nach Kochen mit Triethylamin oder nach Zugabe von CaCl239 in die analoge 3-Acyl-Tetramsäure isomerisiert werden kann (Abb. 49 a). Reagiert 62 in kochendem BF3- Etherat mit einem Säurechlorid nach Jones⁵⁰, so entsteht der analoge 3-Acyl-Tetramsäure-BF2- Komplex (Abb. 49 b), wobei es am Kohlenstoffatom 5 zur Racemisierung kommen kann.

Die 3-Acylierung von Tetramsäuren mit Oligoenoylderivaten nach den obigen beiden Methoden konnte bisher nicht immer erfolgreich durchgeführt werden⁵¹.

Deshalb wurde bei vielen Synthesen ähnlicher Verbindungen auf alternative Wege zur Darstellung von 3-Acyl-Tetramsäuren zurückgegriffen, darunter vor allem die Lacey-Dieckmann-Cyclisierung (Abb. 49 c, siehe Abschnitt 2.10.1). Allerdings stellt dabei ebenfalls die Racemisierung am Kohlenstoffatom 5 durch den notwendigen Einsatz von starken Basen manchmal ein Problem dar.

170 130 100 70 55 35 25

15 10

ÄtOH ohne 131 128 129 130

49

Ziel des zweiten Aufgabenblockes der vorliegenden Arbeit war es, eine dritte Möglichkeit zu etablieren, eine Tetramsäure an Position 3 zu acylieren (Abb. 49 d). Dazu sollte eine 3-Phosphoranylidentetramsäure 96 hergestellt und diese durch Einsatz geeigneter Basen in einer Wittig-Reaktion umgesetzt werden.

Abb. 49 zeigt im Vorgriff auch meinen Erklärungsversuch, warum die Jones- Acylierung direkt zu 3-Acyl-Tetramsäuren führt und auch mit Ketenylidentriphenylphosphoran 43 selektiv das 3-Acyl- Produkt entsteht, obwohl eine Tetramsäure mit einer aktivierten Carbonylverbindung immer die 4-O-Acyl-Tetramsäure bildet, wobei deren Umlagerung zur 3-Acylverbindung teilweise problematisch ist.

N

Abb. 49: Übersicht über unterschiedliche Methoden zur Synthese von 3-Acyl-Tetramsäuren a)

50

Zunächst ist im Enol der Sauerstoff das bessere beziehungsweise härtere Nukleophil, weshalb alle von mir eingesetzten aktivierten Carbonylverbindungen immer von diesem angegriffen wurden. Während meiner Arbeit habe ich einerseits Säuren mit EDC*HCl bzw.

DCC mit katalytischen Mengen DMAP umgesetzt, woraus sich leicht saure Bedingungen ergeben. Andererseits habe ich auch Säurechloride und gemischte Anhydride von Carbonaten und Phosphonaten (T3P) mit Triethylamin eingesetzt, woraus sich basische Bedingungen ergeben.

Das Besondere an der Jones- Acylierung ist die starke Lewis-Säure BF3. Yoda hat in seinen Untersuchungen gezeigt, dass CaCl2 als Lewis- Säure in der Lage ist, die Umlagerung zu katalysieren³⁹. Dabei bestätigten auch meine Reaktionskontrollen mittels HPLC, dass immer zunächst die 4-O- Acyl-Tetramsäure gebildet wird, welche sich dann schneller (α-CH₂) oder langsamer (bei α- Methylsäuren) umlagert. Dabei spielt es kaum eine Rolle, ob die 4-O- Acyl-Tetramsäure zwischendurch aufgereinigt wird, oder ob CaCl2 in die Acylierungslösung gegeben wird. Daher dachte ich, dass auch BF3 lediglich die zunächst 4-O- acylierte Verbindung umlagert. Deshalb versuchte ich an einem problematischen Beispiel (siehe Abschnitt 3.3.5), ob dies auch bei isolierter 4-O- Acyl- Verbindung 135 der Fall ist (Abb. 50).

Zugabe stöchiometrischer Mengen BF3- Etherat leiteten keine Reaktion ein, Intensivierung der Bedingungen (Erhitzen) führte zur Zersetzung.

HN O O

H OH

H H O

HN O O

H H O HN

O O

Cl

F₂ B BF₃OEt₂

BF₃OEt₂

Abb. 50: Synthese von 136 mit Hinweis auf den Mechanismus der Jones- Acylierung

Daraus schließe ich, dass bei der Jones- Acylierung in BF3- Etherat die Tetramsäure als protische Verbindung als erstes (unter HF- Abspaltung) einen intermolekularen nicht-chelatartigen BF2- Komplex bildet (siehe Abb. 49). Durch die Oxophilie von Bor „blockiert“

dieses gewissermaßen den Sauerstoff, wodurch nur noch das Kohlenstoffatom als Nucleophil

„übrigbleibt“. Da der Elektronenzug die Nucleophilie noch weiter herabsetzt, stimmt das Modell mit den experimentellen Befunden überein, dass eine 4-O- Acylierung normalerweise

133 134

135

136*BF2

51

bei Raumtemperatur abläuft, wohingegen die HPLC- Kontrolle der Jones- Reaktion gezeigt hat, dass bei 40°C kaum Produkt erscheint; bei 60°C braucht es immer noch 60 min, bis ein ähnlich hoher Umsatz erreicht ist, wie bei 80°C bereits nach 20 min. Alle diese Temperaturen gelten für geschlossene Gefäße, da die Rückflusstemperatur natürlich zu gering ist.

Für die selektive 3-Acylierung von Ketenylidentriphenylphosphoran 43 schlage ich folgende Begründung vor: Erstens ist das Carbonylkohlenstoffatom von 43 nicht durch ein Heteroatom als Abgangsgruppe aktiviert, was es nach HSAB „weicher“ macht und somit eher mit dem

„weichen“ Kohlenstoffnukleophil des Enoles reagiert. Der Reaktionsmechanismus ist im Gegesatz zur Substitution am Carbonylkohlenstoffatom bei der 4-O- Acylierung hier eine Addition. Somit ist in einer zweistufigen Addition, bei der zuerst ein Protonentransfer als Säure- Base- Reaktion stattfindet die „Abgangsgruppe“ lediglich die Doppelbindung, die sich vom Sauerstoff zum Phosphor verschiebt. Dies ist der wahrscheinlichere Mechanismus, da natürlich Säure- Base- Reaktionen sehr schnell ablaufen und zudem für eine konzertierte Addition die Tetramsäure in der Enolform vorliegen müsste, was durcH-NMR- Spektroskopie nachweislich in apolaren Solventien nicht der Fall ist. Zweitens könnte durch die abwechselnde Abfolge von negativer (rot dargestellt in Abb. 49) und positiver Partialladung eine elektrostatisch kontrollierte Annährung in der Weise erfolgen, dass ein Agriff des C-3 bevorzugt wird.

Nach Analyse dieser Ergebnisse kam mir die Idee für eine weitere Synthesemethode für Methiosetin (siehe Abschnitt 3.3.5)

3.2.1 3-Acylierung von Tetramsäuren mittels Ketenyliden-triphenylphosphoran 43

Im Rahmen meiner Diplomarbeit wurde dazu L-Phenylalanin als Ausgangsverbindung verwendet, da Derivate aromatischer Aminosäuren gut löslich in organischen Lösungs-mitteln, leicht sichtbar unter dem UV-Licht auf der DC-Platte sind und durch π-Stapel-wechselwirkungen möglicherweise sauberer auskristallisieren. Das N-Methyl-Derivat wurde hergestellt, um die während der Diplomarbeit untersuchte Methode zur Darstellung von N-Methyl-Aminosäuren an einem weiteren Beispiel zu testen und weil eine freie NH-Gruppe bei Tetramsäuren teilweise zu unerwünschten Nebenreaktionen durch die Möglichkeit zur Enolisierung tendiert und dadurch auch schnellere Zersetzung stattfindet.

N-Boc-Phenylalanin 137 wurde mit Natriumhydrid deprotoniert und mit Dimethylsulfat gleichzeitig O- und N- alkyliert. Nach Abspaltung der Boc-Schutzgruppe wurde Aminoester 138 mittels der oben bereits erwähnten Dominosynthese zum Tetramat zyklisiert. Dessen

52

Hydrolyse zur freien Tetramsäure 139 wurde zuerst im Basischen mit 4 Äquivalenten Natronlauge unter Rückfluss in Ethanol/ Wasser erfolglos versucht. Das ¹H-NMR-Spektrum zeigte keine Veränderung des Methyl-Tetramates. Nach Standard-bedingungen, das heißt 24 Stunden bei Raumtemperatur in konzentrierter Salzsäure, wurde 139 quantitativ erhalten.

OH

Abb. 51: Darstellung des Tetramsäure-3-Acyylides 140

Die anschließende Acylierung mittels Ketenylidentriphenylphosphoran 43 wurde zuerst unter den von Schobert et al. beschriebenen Standardbedingungen versucht⁵². Obwohl dabei ein weißer Feststoff ausfiel, welcher nicht das Produkt 140 darstellte, war 140 weder auszukristallisieren, noch säulenchromatographisch zu reinigen.

Im Abschlussvortrag der Diplomarbeit habe ich festgestellt, dass nach Einrotieren der Reaktionslösung ein schwarzer zäher „Schlonz“ entstand.

Andrea Schlenk hatte auch schon lange vor mir erfolglos versucht, das Ylid darzustellen, da es ja eine mögliche Vorstufe in ihrer Synthese von Raveninsäure war.

Als nach einigen Monaten bei Raumtemperatur das zähe Öl im Kolben fest geworden war, hatte sich die Konsistenz zu einem braunen krümeligen Feststoff gewandelt, welcher schon eher nach Ylid aussah. Daher habe ich diesen in THF gelöst und ein Äquivalent KOtBu hinzugegeben, woraufhin sich eine deutliche Farvertiefung zeigte. Dann wurde die Lösung über Nacht mit zwei Äquivalenten Anisaldehyd gekocht (Abb. 52).

N

Abb. 52: die erste nachgewiesene „Schlempf- Reaktion“

Nach Einrotieren entstand beim sauren Extrahieren eine fluoreszierende neongelbe Färbung.

Die dünnschichtchromatographische Analyse (Abb. 53) zeigte eine neue Verbindung 142, welche nach Anfärben mit schwefelsaurer Molybdophosphorsäure-Cersulfat- Lösung eine persistierende Gelbfärbung aufwies. Als Referenz aufgetragener PMB- Alkohol 143 zeigt nur eine geringe R_f- Differenz, aber eine deutlich andere Färbung.

137 138 139 140

140 141 142

53

Abb. 53: DC- Analyse der ersten Schlempf- Reaktion a) Rohprodukt und Referenz in Kyklohexan⁵³/EE 1:1 + 1% AcOH; b) Rohprod. und c) Fraktionen der Säulenchromatographie in EE + 1% AcOH, 1% MeOH Nach säulenchromatographie an Silicagel (Abb.53 c) erhielt ich in dieser Fraktion eine geringe Menge eines bräunlichen Öles, welches in Lösung wieder gelb fluoreszierte. Im ¹H- NMR- Spektrum konnte man an den übereinstimmenden Integralen der aromatischen Methoxy- und der N-Methylgruppe deutlich die Verknüpfung des Anisaldehydes mit der Tetramsäure erkennen.

Dies war das erste Mal, dass ein Produkt dieser Wittig-Reaktion nachgewiesen wurde.

Erst danach haben Andrea Schlenk und ich gemeinsam die Darstellung und Isolierung des Ylids verfeinert, sodass es als goldener Schaum gewonnen werden kann. Aufgrund unserer Arbeit bei der Etablierung dieser Methode benannte sie Herr Schobert scherzhaft nach einer Kombination unserer Namen: „Schlempf- Reaktion“.

Im Dokument Synthese von 3-Acyltetramsäurederivaten und deren Markierung zur Visualisierung in Zellen (Seite 44-53)