Tiere

Die Hunde, deren Gehirnmaterial für die Isolation und Charakterisierung der Mikroglia verwendet wurden, stammten aus dem Patientengut der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (siehe Tab. 1). Die Besitzer entschieden sich für eine Euthanasie ihrer Hunde, da diese an unterschiedlichen Erkrankungen mit infauster Prognose erkrankt waren.

Tabelle 1: Darstellung der für die Charakterisierung der Mikroglia rekrutierten Hunde

Hund Rasse Gewicht des verwendeten

Gehirnmaterials

1 Dackel-Mischling 26,1 g

2 Havaneser 29 g

3 Mischling 61,6 g

4 Beagle 60,4 g

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Für die Charakterisierung kaniner Monozyten wurden zehn gesunde adulte Hunde der Rasse Beagle in einem Alter von ein bis sechs Jahren zur Beprobung herangezogen. Fünf von ihnen gehörten zu den Blutspendehunden der Klinik für Kleintiere, die anderen fünf Hunde wurden vom Institut für Pharmakologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt. Die Allgemeinuntersuchung sowie das Blutbild der für die Studie verwendeten Hunde waren unauffällig. Die Genehmigung der Studie wurde von der Landesregierung erteilt (Regierungspräsidium Hannover, Deutschland, Bewilligungsnummer 33.9-42502-05-12A275) und die Probengewinnung und Untersuchung der zehn Hunde wurde entsprechend der Maßgabe des Deutschen Tierschutzgesetzes durchgeführt.

41 3.2 Methoden

3.2.1 Methodik zur Kultivierung kaniner Mikroglia Isolation kaniner Mikroglia

Die angewandte Isolationsmethode kaniner Mikroglia beruht auf einer von Stein (STEIN 2001; STEIN et al. 2004a) für den Hund modifizierten Methode nach Sedgwick et al. (1991).

Den Hunden wurde ein peripherer Venenverweilkatheter gelegt, über den zuerst Heparin (150 IE/kg KGW) und dann Pentobarbital (60 mg/kg KGW) intravenös injiziert wurde. Daraufhin trat der sofortige Tod der Hunde ein, welcher mittels Auskultation des Herzens bestätigt wurde. Unmittelbar nach dem Tod wurde eine Thorakotomie durchgeführt, um die Perfusion über den linken Herzventrikel zu beginnen. Das Abklemmen der Vena cava caudalis unterbrach den Blutfluß zu den abdominalen Organen und das Eröffnen des linken Herzohrs ermöglichte das Abfließen des Blutes und später auch der Perfusionslösung. Der Hund wurde für 30 bis 45 Minuten mit 1 l kalter Sterofundin Infusionslösung perfundiert. Nachdem die Perfusion abgeschlossen war, wurde mittels Kraniotomie das Gehirn entnommen und in eiskalte sterile Hanks´gepufferte Salzlösung (HBBS-Lösung) mit fetalem Kälberserum (FKS) überführt.

Die folgenden Schritte wurden unter einer mikrobiologischen Sicherheitsbank durchgeführt, um Kontaminationen zu vermeiden. Die Meningen wurden anschließend vorsichtig mit einer Pinzette entfernt und das restliche Gehirnmaterial gewogen. Zur Dissoziation wurde das Gehirnmaterial zunächst mit einer Skalpellklinge zerkleinert und danach durch ein Sieb gerieben und mit HBBS-Lösung verdünnt. Der Gewebebrei wurde daraufhin mit Hilfe eines Gewebehomogenisator weiter zerkleinert und weiter aufgeschlossen um dann in ein 50 ml Röhrchen überführt zu werden. Drei Waschschritte mit HBSS-Lösung mit anschließender Zentrifugation bei 170 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 4 °C folgten.

Der Gewebebrei wurde mit Kollagenase-DNAse-Puffer (1 ml pro 1 g Gehirnmaterial) versetzt und für 60 Minuten im Wasserbad bei einer Temperatur von 37 °C verdaut.

Danach wurde die gewonnene Zellsuspension zweimal mit HBSS-Lösung

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gewaschen und bei 200 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C zentrifugiert.

Zur Anfertigung des Dichtevorgradienten wurde das Zellpellet in 45 ml Percoll der Dichte 1,030 g/ml resuspendiert und mit 5 ml Percoll der Dichte 1,124 g/ml unterschichtet, um dann anschließend bei 1250 x g bei einer Temperatur von 20 °C für 5 Minuten bei geringster Beschleunigungs- und Bremsstufe zentrifugiert zu werden. Nach der Zentrifugation befanden sich Myelin und Zelldebris auf der obersten Schicht des Gradienten und wurden verworfen, nur Zellen auf Percoll der Dichte 1,124 g/ml wurden gewonnen und in HBBS-Lösung resuspendiert.

Zellseparation mittels Dichtegradientenzentrifugation

Nach erneutem Waschen und Zentrifugieren bei 200 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C wurde das gewonnene Zellpellet mit 5 ml HBSS-Lösung resuspendiert und auf die Hauptgradienten verteilt. Pro 8 g ursprünglichem Gehirnmaterial wurde ein Hauptgradient gegossen. Der Hauptgradient bestand aus fünf übereinander geschichteten Dichten. Zuerst wurde 5 ml Percoll der Dichte 1,124 g/ml in ein 50 ml Röhrchen vorgelegt, darauf wurden 12 ml Percoll der Dichte 1,077 g/ml, gefolgt von weiteren 12 ml Percoll der Dichte 1,066 g/ml, 8 ml Percoll der Dichte 1,050 g/ml und 8 ml Percoll der Dichte 1,030 g/ml. Die erstellten Gradienten wurden bei 1250 x g für 25 Minuten bei einer Temperatur von 20 °C bei geringster Beschleunigungs- und Bremsstufe zentrifugiert.

Die Zellen auf den Percoll-Dichten 1,077 g/ml und 1,066 g/ml wurden geerntet und mit HBBS-Lösung resuspendiert, um erneut bei 200 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C zentrifugiert zu werden. Anschließend wurden die Zellen mit Trypanblau angefärbt und in der Zählkammer nach Türk auf Anzahl und Vitalität untersucht. Die verbleibende Zellsuspension wurde erneut bei 200 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C zentrifugiert.

43 Separation mittels autoMACS^pro

Das Zellpellet wurde in 80 µl Magnetic-activated cell sorter (MACS) -Puffer pro 10⁷ Zellen resuspendiert und mit 20 µl CD11b MicroBeads pro 10⁷ Zellen für 15 Minuten bei 4-8 °C inkubiert. Nach einmaligem Waschen mit MACS-Puffer und Zentrifugation bei 300 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C wurde das Zellpellet in 500 µl MACS-Puffer pro 10⁸ Zellen resuspendiert, bevor es in ein 15 ml Röhrchen überführt wurde, um mit dem autoMACS^pro zweimal separiert zu werden. Die positive Zellfraktion wurde dann mit Trypanblau angefärbt und erneut in der Zählkammer nach Türk auf Anzahl und Vitalität untersucht. Die restlichen Zellen der positiven Fraktion wurden bei 300 x g für zehn Minuten bei einer Temperatur von 20 °C zentrifugiert und das Zellpellet in Microglia Medium (MM-prf) überführt und zur weiteren Bebrütung in den Brutschrank mit einem Gehalt von 5 % Kohlenstoffdioxid (CO2) und einer Temperatur von 37 °C gelegt.

Lichtmikroskopische Zählung der Zellzahl

10 µl der isolierten Zellsuspension wurden mit 90 µl 0,4 % Trypanblau verdünnt, wovon 10 µl in die Zählkammer nach Türk überführt wurden. Lebende Zellen mit einer intakten Zellwand stellten sich farblos dar, tote Zellen erschienen blau, da der Farbstoff durch die zerstörte Zellwand in den Interzellularraum gelangen konnte. Die Zellzahl der lebenden Zellen wurde ermittelt, indem drei der mittelgroßen Quadrate mit einer Länge von 1 mm und einer Tiefe von 0,1 mm auszählt wurden, was einen Rauminhalt pro Quadrat von 0,1 mm³ widerspiegelte. Der Mittelwert der drei gewonnenen Zellzahlen wurde mit dem Faktor zehn multipliziert, um die Zellzahl der verdünnten Suspension pro 1 µl wiederzugeben. Um die Verdünnung mit zu berücksichtigen, wurde das Ergebnis erneut mit 10.000 multipliziert, um die Zellzahl pro 1 ml der unverdünnten Zellsuspension zu errechnen.

Herstellung der Dichten mit Percoll

Um Vor- und Hauptgradienten zu gießen, mussten vorher die benötigten Dichten hergestellt werden. Dazu wurde Percoll mit 1,5 M NaCl-Lösung in einem Verhältnis von 1:10 vermischt. Die Dichte dieser isotonen Lösung entsprach 1,124 g/ml. Zur Herstellung der weiteren unterschiedlichen benötigten Dichten (1,077 g/ml,

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1,066 g/ml, 1,050 g/ml und 1,030 g/ml) wurde HBSS-Lösung nach Herstelleranweisungen hinzugefügt.

Prinzip des autoMACS^pro

CD11b MicroBeads sind superparamagnetische Teilchen, die an CD11b-Antikörper gekoppelt sind. Bei Zugabe der CD11b MicroBeads zu der Zellsuspension bindet der CD11b-Antikörperteil der MicroBeads an die CD11b-Oberflächenmarker der Mikrogliazellen. Das autoMACS^pro separiert die Zellen anhand der CD11b-Expression. Dazu passiert die Zellsuspension mit den CD11b MicroBeads-gekoppelten und den nicht MicroBeads-gekoppelten Zellen eine magnetisch aufgeladene Säule, an der die gekoppelten Zellen aufgrund der superparamagnetischen MicroBeads haften bleiben. Nachdem die negative Fraktion, also die nicht gekoppelten Zellen, die Säule passiert hat und in einem Röhrchen aufgefangen wurde, schaltet das autoMACS^pro die Magnetsäulen aus und die positive Fraktion wird in ein separates Röhrchen abgegeben. So wird innerhalb weniger Minuten eine weitere Aufreinigung der vorher mittels Dichtegradienten separierten Mikrogliapopulation erreicht.

Infektion kaniner Mikroglia mit Staupevirus

Die Zellmenge der kultivierten Mikroglia wurde gedrittelt und in jeweils eine Vertiefung einer separaten 12-Wellplatte gegeben. Die Virusstämme R252 und Onderstepoort wurden jeweils mit 0,1 multiplicity of Infection (MOI) eingesetzt. Es wurden separate Platten für die verschiedenen Virusstämme und die Negativkontrolle verwendet um Kontaminationen zu vermeiden. Zu den Zellen in der Vertiefung der ersten Wellplatte wurde der Virusstamm R252, in die Vertiefung der zweiten Wellplatte der Virusstamm Onderstepoort und in die Vertiefung der dritten Wellplatte wurde als Negativkontrolle HBBS-Lösung hinzugegeben. Nach einer Inkubationszeit von einer Stunde im Brutschrank bei 37 °C und 5 % Kohlenstoffdioxidgehalt wurden die infizierten Zellen in 15 ml Röhrchen überführt und dreimal mit HBBS-Lösung gewaschen und jeweils für zehn Minuten bei 170 x g zentrifugiert. Danach wurden die Zellsuspensionen der drei Zellpopulationen (R252, Onderstepoort und Negativkontrolle) jeweils in vier Teile geteilt. Ein Teil wurde direkt weiter bearbeitet und die anderen drei Teile wurden in jeweils eine eigene

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Vertiefungen einer 6-Wellplatten überführt und kamen zur weiteren Bebrütung in den Brutschrank bei 37 °C und 5 % Kohlenstoffdioxidgehalt. Nach zwei, vier und sechs Stunden wurden jeweils die Zellen einer Vertiefung der 6-Wellplatten von jedem Versuchsansatz zur weiteren Bearbeitung entnommen.

Kultivierung kaniner Mikroglia

Die gewonnenen Mikroglia wurden in eine mit einem Kulturmedium gefüllte Zellkulturflasche überführt und in einen Brutschrank mit 37 °C und einem Kohlenstoffdioxidgehalt von 5 % verbracht. Einen, drei und acht Tage nach dem Beginn der Kultivierung wurde jeweils ein Mediumwechsel durchgeführt.

Indirekte Membran-Immunfluoreszenz

Durch den Nachweis der Expression der Oberflächenmoleküle CD11b, CD18 und CD45^low, welche in ihrer Kombination spezifisch für die kaninen Mikroglia sind (STEIN 2001), soll die Reinheit der isolierten Mikrogliazellpopulation ermittelt werden.

Nachdem die Zellsuspension auf eine Zellzahl von 2 x 10⁵ Zellen pro 50 µl PBS eingestellt wurde, wurden mittels humanem Immunglobulin G (IgG) unspezifische Bindungen geblockt, um Hintergrundfluoreszenzen zu reduzieren. Danach wurden die Zellen gleichmäßig in fünf Röhrchen aufgeteilt und wie folgt beschriftet:

Nativkontrolle, Isotypkontrolle, Sekundärantikörperkontrolle, Teströhrchen CD11b und CD45^low sowie Teströhrchen CD18 und CD45^low. In das Isotypkontroll-Röhrchen wurden die Isotypkontrollen Ratte IgG2b konjugiert mit Biotin und Maus IgG1

pipettiert. In die Röhrchen der Nativ- und Sekundärantikörperkontrolle wurde MIF-Puffer hinzugefügt und in die beiden Teströhrchen wurde ihrer Beschriftung entsprechend der Primärantikörpern Ratte-anti-Hund CD45 konjugiert mit Biotin, Maus-anti-Hund CD11b und Maus-anti-Hund CD18 pipettiert. Alle Röhrchen wurden für 20 Minuten bei 4 °C inkubiert. Darauf folgten zwei Waschschritte mit MIF-Puffer mit anschließender Zentrifugation über sechs Minuten bei 200 x g. Anschließend erfolgte die Zugabe der Sekundärantikörper Ziege-anti-Maus IgG konjugiert mit R-Phycoerythrin und Fluoreszin-Isothiocyanat konjugiert mit Streptavidin in alle

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Röhrchen außer der Natikontrolle, welche mit MIF-Puffer versetzt wurde. Danach fand eine Inkubation aller Röhrchen für 20 Minuten bei 4 °C statt. Vor dem Messen im Durchflusszytometer erfolgte ein weiterer Waschschritt mit CellWash und Zentrifugieren für sechs Minuten bei 200 x g. Die Zellen wurden anschließend in Fluorescence-activated cell sorter (FACS) Flow resuspendiert. Unmittelbar vor der Messung wurde FACSFlow mit TO-PRO-3 in einer Verdünnung von 1:1.000 hinzugefügt.

Intrazelluläre Staupevirus-Antigen-Färbung

Die Zellen wurden zuerst mit 4%igem Paraformaldehyd fixiert. Nach einer Inkubationszeit von 20 Minuten bei 4 °C wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und für jeweils zehn Minuten bei 250 x g bei 4 °C zentrifugiert. Daraufhin erfolgten die Permeabilisierung der Zellmembran mit 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung und das Blocken unspezifischer Bindungen mit humanem IgG. Die Zellsuspensionen wurden auf vier Röhrchen (Nativkontrolle, Isotypkontrolle, Sekundärantikörperkontrolle und CDV-Ag-Teströhrchen) verteilt. In das Nativ- und Isotypkontrollröhrchen wurde 0,03%ige PBS-Saponin-Lösung und in das Isotypkontrollröhrchen Maus IgG1 hinzugefügt. Der monoklonale Primärantikörper anti-CDV-NP D110, der die Nukleoproteine der Staupeviren detektiert, wurde in das CDV-Ag-Teströhrchen hinzu gegeben und alle Röhrchen wurden für 30 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach dem Ablauf der Inkubationszeit wurde zweimal mit 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung gewaschen und für je fünf Minuten bei 250 x g bei 4 °C zentrifugiert. Der an R-Phycoerythrin gekoppelte Sekundärantikörper Ziege-anti-Maus IgG wurde in alle Röhrchen pipettiert, außer in die Nativkontrolle, da diese mit 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung versetzt wurde. Anschließend wurden alle Röhrchen für 30 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach zwei Waschschritten mit 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung und Zentrifugation für fünf Minuten bei 250 x g wurden die Zellpellets in FACSFlow resuspendiert und im Durchflusszytometer gemessen.

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3.2.2 Methodik zur Charakterisierung kaniner Monozyten Isolation und Infektion peripherer mononukleärer Zellen

Den Hunden wurde 10 ml Vollblut durch die Punktion der V. cephalica antebrachii und/oder V. saphena lateralis entnommen und in einem EDTA-Röhrchen aufgefangen. Anschließend wurde die Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt.

Dazu wurden 2 ml Histopaque in ein 15 ml Röhrchen pipettiert und mit 5 ml Pancoll der Dichte 1,077 g/ml überschichtet, gefolgt von maximal 6 ml in PBS verdünntem Vollblut (Verdünnung 1:1). Um 10 ml Vollblut zu verteilen wurden vier Gradienten gegossen, welche bei 700 x g für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert wurden. Nach dem Zentrifugieren haben sich die Zellen entsprechend ihrer Dichte auf den verschiedenen Schichten angesammelt. Die Interphase zwischen dem Plasma und dem Pancoll bestand aus der Akkumulation mononukleärer Zellen.

Diese Zellschicht wurde abpipettiert und dreimal mit HBSS-Lösung gewaschen und zweimal bei 170 x g und einmal bei 250 x g für zehn Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Falls das Zellpellet mit Erythrozyten kontaminiert war, wurde eine hypotone Lyse durchgeführt. Bei der hypotonen Lyse wurde das Zellpellet mit 5 ml Aqua dest. für 20 Sekunden resuspendiert und danach mit 5 ml doppelt konzentriertem PBS aufgefüllt und bei 170 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach dem letzten Waschschritt wurde der Überstand verworfen und das Monozyten-Zellpellet in CellWash resuspendiert. Die Anzahl der lebenden Zellen wurde mittels Zählkammer nach Türk bestimmt.

Staupevirusinfektion

Die isolierte Monozyten-Zellsuspension wurde gedrittelt und jeweils in ein 15 ml Röhrchen gegeben. Ein Röhrchen wurde mit 0,1 multiplicity of infection des CDV-Impfstamms Onderstepoort und das andere mit 0,1 multiplicity of infection des virulenten Staupevirusstamm R252 versetzt. In dem dritten Röhrchen wurden die Monozyten mit HBSS-Lösung versetzt und dienten als Negativkontrolle. Nach einer Stunde im Inkubator bei einer konstanten Temperatur von 37 °C und einem CO2-Gehalt von 5 % wurden die Zellen dreimal mit HBSS-Lösung gewaschen und jeweils für zehn Minuten bei 170 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach der Infektion wurden die Zellen der verschiedenen Versuchsansätze (Ktr, Ond und R252)

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geteilt. Der erst Teil wurde direkt post infectionem (p.i.) gemessen und der zweite Teil wurde nach drei weiteren Stunden der Inkubation (3 Stunden p.i.) gemessen.

Für diese zwei Messzeitpunkte wurde jeweils die Expression des Oberflächenmoleküls CD14, das intrazelluläre CDV-Ag und die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies für jeweils die Negativkontrolle und die OND-, bzw.

R252-infizierten Monozyten mittels FACS-Analyse evaluiert.

Durchflusszytometrie

Die Identifikation der Monozyten wurde mit der Cell-Quest-Software durchgeführt und die Populationen der Monozyten und Lymphozyten anhand ihrer Größe (forward scatter, FSC) und Komplexität (side scatter, SSC) voneinander differenziert.

Detektion des Oberflächenmoleküls CD14

Die Membran-Immunfluoreszenz wurde, wie bereits von Stein et al. (2004a) beschrieben, durchgeführt. Fc-Rezeptoren wurden mit humanem IgG geblockt, um Hintergrundfluoreszenzen zu minimieren. Danach wurde die Zellsuspension in drei Teile geteilt (Nativkontrolle, Isotypkontrolle, CD14-Teströhrchen). Die Zellsuspension der Nativkontrolle wurde mit MIF-Puffer, die Zellsuspension der Isotypkontrolle mit R-Phycoerythrin-konjugiertem Ziege-anti-Maus IgG und die Zellsuspension aus dem CD14-Teströhrchens mit direkt R-Phycoerythrin-konjugierten mononukleärer Antikörper gegen CD14 versetzt und für 20 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach einmaligem Waschen mit MIF-Puffer wurden die Zellen bei 300 x g für zehn Minuten bei 10 °C zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in FACSFlow mit TO-PRO-3 in einer Verdünnung von 1:1.000 resuspendiert und direkt im FACSCalibur gemessen. Pro Messung wurden insgesamt 10⁴ live-gated events pro Messung analysiert. Der cut-off wurde so gesetzt, dass nicht mehr als 2 % der Zellen der Negativkontrolle ein positives Signal zeigten.

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Detektion des Staupevirusantigens in den Monozyten

Die intrazelluläre Identifikation des CDV in den Monozyten wurde nach den Angaben in der Literatur (CHERPILLOD et al. 2000) durchgeführt. Nach einer Fixation der Monozyten mit 4%igem Paraformaldehyd für 20 Minuten bei 4 °C wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und jeweils bei 250 x g für zehn Minuten zentrifugiert.

Um die Zellmembran zu permeabilisieren, wurden 150 µl einer 0,03%igen PBS-Saponin-Lösung zu dem Zellpellet hinzu gegeben. Humanes IgG wurde zum Blocken des Fc-Rezeptors benutzt. Die Zellsuspensionen der drei Versuchsansätze (Ktr, OND, R252) wurden gedrittelt und in drei Röhrchen überführt (Nativkontrolle, Sekundärantikörperkontrolle und CDV-Ag-Teströhrchen). In die Nativ- und Sekundärantikörperkontrolle wurde 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung und in das CDV-Ag-Teströhrchen der gegen das Nukleoprotein gerichtete Antikörper D110 in einer Verdünnung von 1:16 hinzugefügt und für 30 Minuten bei 4 °C inkubiert.

Danach folgten zwei Waschschritte mit 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung und Zentrifugation bei 250 x g für fünf Minuten bei 10 °C. Der R-Phycoerythrin-konjugierte Sekundärantikörper Ziege-anti-Maus wurde in die Sekundärantikörperkontrolle und in das CDV-Ag-Teströhrchen hinzugefügt und erneut für 30 Minuten bei 4 °C inkubiert.

Nach zwei letzten Waschschritten mit 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung und Zentrifugation bei 250 x g für fünf Minuten bei 10 °C, wurde das Zellpellet in FACSFlow resuspendiert und unverzüglich im Durchflusszytometer gemessen. Es wurden wiederum 10⁴ live-gated events pro Probe analysiert und der cut-off so adjustiert, dass nicht mehr als 2 % der Zellen der Negativkontrolle ein positives Signal zeigten.

Detektion der ROS-Produktion von Monozyten

Die Detektion der ROS-Produktion von Monozyten wurde, wie in der Literatur für Mikrogliazellen beschrieben durchgeführt (STEIN et al. 2004a). Pro Versuchsansatz wurden jeweils 90 µl Zellsuspension in eins von fünf Röhrchen überführt und anschließend für 15 Minuten bei 37 °C mit einem CO2 Gehalt von 5 % inkubiert.

Nach der Inkubation wurden, da der Versuch im Doppenansatz durchgeführt wurde, 10 µl PMA in zwei Röhrchen pipettiert. Phorbol Myristat Acetat triggert die ROS-Produktion in den Zellen. In die verbleibenden drei Röhrchen wurden 10 µl PBS pipettiert, wobei ein Röhrchen davon als Nativkontrolle geführt wurde. Nach einer

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weiteren Inkubationsperiode aller Röhrchen von 15 Minuten bei 37 °C mit 5 % CO2

wurde allen Ansätzen außer der Nativkontrolle 20 µl des nicht-fluoreszierenden Dihydrorhodamin 123 zugefügt und wiederum unter den gleichen Bedingungen wie zuvor für 15 Minuten inkubiert. In dieser Zeit wandelt das von den Monozyten produzierte ROS das Dihydrorhodamin 123 (DHR) in das fluoreszierende Rhodamin 123 um. Nach der Inkubation wurden die Zellen 15 Minuten auf Eis gestellt, um die Rhodamin 123 Umwandlung innerhalb der Zellen zu stoppen. Daraufhin wurden die Zellen mit FACSFlow und TO-PRO-3 in einer Verdünnung von 1:1.000 im Durchflusszytometer gemessen. Es wurden 10⁴ live-gated events pro Probe analysiert. Der cut-off wurde in der Negativkontrolle so adjustiert, dass das Signal der Population der nicht-getriggerten Monozyten als negativ detektiert wurde. Da die Versuche im Doppelansatz durchgeführt wurden, wurden der Mittelwerte aus beiden Ergebnissen zur weiteren Analyse verwendet.

3.2.3 Statistik über die Charakterisierung kaniner Monozyten

Der Spearmans Rangkorrelationskoeffizient wurde ermittelt, um eine Korrelation zwischen den einzelnen Merkmalen der infizierten Monozyten zu evaluieren. Ein p-Wert von < 0,05 wurde als signifikant festgelegt. Zum Vergleich der Resultate für die Negativkontrolle, sowie die OND- und R252-infizierten Monozyten und der zwei Messzeitpunkte wurde eine ein- und zweifaktorielle Varianzanalyse durchgeführt. Bei dem globalen F-Test wurde ein f-Wert von < 0,05 als signifikant definiert. Um die Details der Gruppenzusammenhänge zu evaluieren, wurde ein Student´s T-Test durchgeführt, bei dem ein p-Wert von < 0,05 als signifikant galt. Die Statistik wurde mit dem Programm SAS Version 9.2 durchgeführt. Die Boxplots wurden mit dem Programm GraphPad Prism 6 erstellt.

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Ergebnisse

4.1 Ergebnisse der Mikroglia-Isolation

Zur Identifizierung der kaninen Mikroglia wurden phänotypische Merkmale, wie die Größe (FSC) und Komplexität (SSC) der Zellen (Abb. 1), sowie die Expression der Oberflächenmarker CD11b, CD18 (Abb. 2) und CD45 herangezogen. Die Expression von CD18, CD11b/c und CD45^low sind als Mikroglia-spezifisch in der Literatur beschrieben (FORD et al. 1995; STEIN et al. 2004a), während im Gegensatz dazu die Makrophagen eine Expression von CD11b/c und CD45^high aufweisen (SEDGWICK et al. 1991; FORD et al. 1995).

Abbildung 1: Darstellung der isolierten Mikroglia-Population im Dot Plot mit den Merkmalen Größe (forward scatter, FSC) und Komplexität

(side scatter, SSC).

Aufgrund der relativ uniformen Größe und Komplexität ist die Population innerhalb des roten Gates sehr gut erkennbar. Die Zellen rechts von der Mikroglia-Population stellen zusammengelagerte Mikrogliazellen dar, die somit ein höheres Signal in dem forward scatter aufweisen.

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Abbildung 2: Darstellung der Mikroglia-Population im Dot Plot im Fluoreszenzkanal 2 (FL2-H)

Der Cut-off wurde in der Isotypkontrolle (a) so gesetzt, dass nicht mehr als

Der Cut-off wurde in der Isotypkontrolle (a) so gesetzt, dass nicht mehr als

Im Dokument Untersuchungen über den Einfluss der akuten Staupevirusinfektion auf die Funktion ex vivo kultivierter kaniner Monozyten (Seite 39-0)