4 Ergebnisse
4.1 Ergebnisse der Mikroglia-Isolation
Zur Identifizierung der kaninen Mikroglia wurden phänotypische Merkmale, wie die Größe (FSC) und Komplexität (SSC) der Zellen (Abb. 1), sowie die Expression der Oberflächenmarker CD11b, CD18 (Abb. 2) und CD45 herangezogen. Die Expression von CD18, CD11b/c und CD45low sind als Mikroglia-spezifisch in der Literatur beschrieben (FORD et al. 1995; STEIN et al. 2004a), während im Gegensatz dazu die Makrophagen eine Expression von CD11b/c und CD45high aufweisen (SEDGWICK et al. 1991; FORD et al. 1995).
Abbildung 1: Darstellung der isolierten Mikroglia-Population im Dot Plot mit den Merkmalen Größe (forward scatter, FSC) und Komplexität
(side scatter, SSC).
Aufgrund der relativ uniformen Größe und Komplexität ist die Population innerhalb des roten Gates sehr gut erkennbar. Die Zellen rechts von der Mikroglia-Population stellen zusammengelagerte Mikrogliazellen dar, die somit ein höheres Signal in dem forward scatter aufweisen.
52
Abbildung 2: Darstellung der Mikroglia-Population im Dot Plot im Fluoreszenzkanal 2 (FL2-H)
Der Cut-off wurde in der Isotypkontrolle (a) so gesetzt, dass nicht mehr als 2 % der Zellen ein positives Signal aufweisen. Bei Übertragung dieses cut-offs auf das Testfeld (b) stellen sich 86,5 % der Zellen CD18+ dar.
Zur Herstellung einer reinen Zellkultur sollte eine möglichst reine Mikroglia-Population isoliert werden. Die Reinheit der Mikroglia nach Dichtegradienten-zentrifugation liegt beim Hund bei circa 86 % - 98 % (STEIN et al. 2004a). Daher ergab sich die erste zu bearbeitende Fragestellung, ob durch eine Isolation mittels MACS eine höhere Aufreinigung der Zellpopulation erzielt werden kann, als durch die übliche Isolationsmethode mittels Dichtegradientenzentrifugation (STEIN et al.
2004b). Für den Vergleich wurden 26,1 g Gehirnmaterial eines Hundes (Tab. 1) als Ausgangsmaterial genutzt. Nach der Zentrifugation des Vorgradienten wurde die Zellsuspension auf zwei Proben aufgeteilt, wovon die Zellen der einen Probenhälfte über das MACS und die andere mittels Dichtegradientenzentrifugation separiert wurden. Die Messergebnisse beider Methoden wurde direkt verglichen. Die Isolation mit dem MACS erzielte 2,6 x 106 Zellen/ml mit einerVitalität von 68,5 %, während die Isolation mittels Dichtegradientenzentrifugation eine Gesamtzellzahl von 2,3 x 106 Zellen/ml mit einer Vitalität von 60 % erreichte. Zur Identifikation der Mikrogliazellen und Bestimmung ihrer Reinheit wurde ihre Größe und Komplexität und die Expression der Oberflächenmarker CD11b und CD45 gemessen. Die isolierte Zellpopulation, die mittels MACS aufgereinigt wurde, zeigte 10,8 % CD11b+ und 8,5
% CD45low+ Zellen, während von der Zellpopulation, die mittels Dichtegradientenzentrifugation separiert wurde, 84,3 % CD11b+ (Abb. 3) und 29,8 % CD45low+ exprimierten.
2% 86,5%
a) Isotyp b) CD18-positive Zellen
2% 86,5%
a) b)
2% 86,5%
2% 86,5%
a) Isotyp b) CD18-positive Zellen
53
Somit konnte zwar bei der Isolation mittels MACS eine geringfügig höhere Zellausbeute erzielt werden, jedoch war die Reinheit der mittels Dichtegradientenzentrifugation gewonnenen Zellen deutlich höher als bei der Isolation mit dem MACS.
Abbildung 3: Darstellung der CD11b+ Zellen nach Isolation mittels Dichtegradientenzentrifugation im Histogramm.
Die X-Achse stellt den Fluoreszenzkanal 2 (FL2-H) und die Y-Achse stellt die Zellzahl dar. Die Negativkontrolle (Isotypkontrolle, pink) lässt sich deutlich von den CD11b+ Zellen (türkis) abgrenzen.
Für die Charakterisierung des Reaktionsprofils der Mikroglia in der Kultur wurden optimale Kulturbedingungen definiert. Als Kulturmedium wurde das Sato-Medium (Kap. 2.1.2) verwendet, welches in der Literatur zur Isolierung von Mikroglia aus einer Mischkultur erfolgreich benutzt wurde (KRUDEWIG 2006). Das Sato-Medium wurde mit und ohne Zugabe von Monozytenkolonie-stimulierendem Faktor (m-csf) eingesetzt und die Mikroglia in Bezug auf Vitaliät mit der Zählkammer nach Türk und der Immunphänotyp im Durchflußzytometer evaluiert.
Die isolierten Zellen wurden insgesamt neun Tage in Kultur gehalten. Die Mediumwechsel fanden an Tag 1, 3 und 8 nach der Aussaat statt. An Tag 6 (Tab. 2) und 9 (Tab. 3) wurde die Expression der Oberflächenmarker CD11b und CD18 gemessen.
negativ CD11b
54
Tabelle 2: Expression von CD11b und CD18 auf Zellen nach sechs Tagen in Kultur mit Sato-Medium + / - m-csf
Isolationsmethode Kulturmedium CD11b CD18
MACS Sato-Medium
Tabelle 3: Expression von CD11b und CD18 auf Zellen nach neun Tagen in Kultur mit Sato-Medium + / - m-csf
Isolationsmethode Kulturmedium CD11b CD18
MACS Sato-Medium
Die mittels Dichtegradientenzentrifugation separierten Zellen in Sato-Medium ohne m-csf konnten ab Tag sechs aufgrund von bakteriellem Wachstum in den Kulturflaschen nicht mehr evaluiert werden. Wie aus Tabelle 2 und 3 ersichtlich, ist der Anteil CD11b und CD18 exprimierender Zellen, die mittels Dichtegradienten-zentrifugation isoliert wurden, deutlich höher als der Anteil derer, die mittels MACS aufgereinigt wurden. Daher ist davon auszugehen, dass die Dichtegradientenzentri-fugation mit anschließender Kultivierung im Sato-Medium + m-csf eine bessere Methode darstellt als die Isolation mit dem MACS und der Kultivierung mit Sato-Medium - m-csf.
55
Um die Reinheit der isolierten Zellpopulation für die Etablierung einer Mikroglia-Reinkultur zu optimieren, wurde in einer nächsten Fragestellung evaluiert, ob eine auf die Dichtegradientenzentrifugation folgende MACS (DG + MACS) in einer effektiveren Aufreinigung dieser Zellpopulation resultiert. Zudem wurde die Kultivierung der Zellen in zwei verschiedenen Medien untersucht, in Sato-Medium mit m-csf und in Phenolrot-freiem Microglia Medium (MM-prf). Die Zellen wurden inklusive dem Tag der Isolation täglich auf ihre Zellzahl pro ml, ihre Vitalität und die Expression der Oberflächenmarker CD11b und CD18 im Durchflußzytometer untersucht. Die Anzahl und Vitalität der Zellen wurden mittles Zählkammer nach Türk unter Zugabe von TO-PRO-3 bestimmt. Es erfolgte jeden Tag ein Mediumwechsel.
Die Zellen wurden insgesamt 4 Tage in Kultur gehalten.
29 g Gehirnmaterial eines Hundes wurde auf zwei Ansätze mit je 14,5 g Gehirnmaterial aufgeteilt. Aus einem der beiden Ansätze wurden die Mikrogliazellen mittels DG + MACS isoliert und aufgereinigt, während die Mikroglia aus dem anderen Ansatz lediglich mittels MACS separiert wurden. Der erste Ansatz mit DG + MACS lieferte am Tag der Isolation eine Zellzahl von 1,2 x 106 Zellen/ml mit einer Vitalität von 62 %, wobei der zweite Ansatz mit Isolation via MACS eine Zellzahl von 2,0 x 106 Zellen/ml mit einer Vitalität von 50 % ergab.
Von den mittels DG + MACS isolierten Zellen aus dem Gehirnmaterial zeigten 45,3 % eine Expression von CD11b und 49,7 % exprimierten CD18. Bei den mittels MACS isolierten Zellen war der Anteil CD11b- und CD18-exprimierender Zellen niedriger; es wiesen 12,1 % eine Expression von CD11b und 44,8 % eine Expression von CD18 auf.
An Tag 1 in Kultur wurden bei den mittels MACS isolierten und in MM-prf kultivierten Zellen mehr CD11b- und CD18-positive Zellen gemessen (Tab. 4), im Vergleich zu den Ergebnissen am Tag der Isolation. Wenn man die Kulturmedien der Isolationsmethode DG + MACS vergleicht, dann ist das MM-prf als Kulturmedium besser geeignet, da mehr Zellen CD11b und CD18 exprimieren im Vergleich zum Sato-Medium (Tab. 4). Zudem ist auch in dieser Kombination aus Isolationsmethode und Kulturmedium die Vitalität der Zellen am höchsten und die Zellzahl ist nur bei der mittels MACS isolierten Zellen mit Sato + m-csf höher, allerdings mit deutlich niedriger Zellvitalität (Tab. 4). Aufgrund eines technischen Fehlers konnten die
56
Zellen, welche mittels MACS isoliert und mit Sato + m-csf kultiviert wurden, am Tag eins in Kultur nicht weiter verwendet werden.
Tabelle 4: Vergleich der Methoden DG + MACS und MACS zur Isolation von Mikrogliazellen aus Gehirnmaterial eines Hundes.
Es wurde die Expression von CD11b und CD18, die Vitalität sowie die Zellzahl pro ml an Tag 1 in Kultur in zwei verschiedenen Kulturmedien, Sato + m-csf und MM-prf untersucht.
Isolationsmethode Kultur
-medium CD11b CD18 Vitalität Zellzahl DG + MACS Sato + m-csf 8,0 % 57,7 % 23,7 % 2,5 x105/ml DG + MACS MM-prf 27,7 % 59,6 % 41,8 % 4,4 x105/ml
MACS Sato + m-csf n.m. 31,1 % 5,1 x105/ml
MACS MM-prf 29,1 % 58,2 % 35,8 % 2,8 x105/ml
Es gelang nicht, die isolierten Mikrogliazellen länger als 24 Stunden in Kultur zu halten. An Tag 2, 3 und 4 konnten keine CD11b+ oder CD18+ Zellen im Durchflusszytometer detektiert werden. Aufgrund dieses Ergebnisses wurde im Folgeversuch der Untersuchungszeitraum auf die ersten 24 Stunden nach Isolation festgelegt.
Die besten Ergebnisse zur Isolation von Mikroglia aus Gehirnmaterial wurden mit der Dichtegradientenzentrifugation und anschließender MACS-Separation und einer Kultivierung der Zellen in dem Kulturmediums MM-prf erziehlt, da in dieser Kombination der höchste Prozentsatz an CD11b- und CD18-positiven Zellen (Abb. 4), sowie die zweithöchste Zellzahl pro ml mit prozentual den meisten vitalen Zellen ermittelt wurde.
57
Abbildung 4: Darstellung der CD11b+ und CD18+ Zellen nach
Dichtegradientenzentrifugation und MACS-Separation im Histogramm.
Die X-Achse stellt den Fluoreszenzkanal 2 (FL2-H) und die Y-Achse die Zellzahl dar. Die Negativkontrolle (pink) lässt sich deutlich von den CD11b+ Zellen (türkis) und CD18+ Zellen (blau) abgrenzen.
Zur Untersuchung des Reaktionsprofils der Mikroglia nach Staupevirusinfektion ergab sich die nächste Fragestellung, ob sich Mikrogliazellen in vitro mit Staupeviren infizieren lassen. Dazu wurden die Mikroglia aus 61,6 g Gehirnmaterial eines Hundes mittels Dichtegradientenzentrifugation und anschließender MACS-Separation isoliert.
Dies resultierte in einer Gesamtzellzahl von 1,56 x 106 Zellen/ml. Um Unterschiede im Reaktionsprofil der Mikroglia in Abhängigkeit des verwendeten Staupevirusstamms zu evaluieren, wurde die isolierte Zellmenge auf drei Ansätze verteilt. Im ersten Ansatz wurden 5,2 x 105 Zellen mit 0,1 MOI des Staupevirusstammes R252 und im zweiten Ansatz wurden 5,2 x 105 Zellen mit 0,1 MOI des Staupevirusimpfstamms Onderstepoort hinzugefügt. Der dritte Ansatz war die Negativkontrolle und zu 5,2 x 105 Zellen wurde HBSS-Lösung hinzu gegeben. Alle drei Ansätze wurden für eine Stunde inkubiert. Nach dem Inkubationsende (Stunde 0), sowie nach 2, 4 und 6 Stunden wurde die Expression von CD18 und CD45low mittels Durchflusszytometrie bestimmt (Tab. 5).
negativ
CD11b
negativ CD18
CD11b
CD18
58
Tabelle 5: Anteil CD18- und CD45low-exprimierender Zellen direkt nach Inkubationsende, sowie 2, 4 und 6 Stunden nach Inkubationsende.
Infektion der Zellen
Stunden nach Inkubationsende
0 2 4 6
CD18 CD45low CD18 CD45low CD18 CD45low CD18 CD45low HBSS
(Ktr) 90 % 4 % 67,3 % 3,5 % 64,4 % 7,5 % 45,4 % 2,9 % OND 86,5 % 3,5 % 44,3 % 2,6 % 73,7 % 3,7 % 71,4 % 3,4 % R252 90,9 % 4,5 % 69,2 % 3,8 % 91,7 % 3,9 % 72,5 % 3,4 %
Die Expression des Oberflächenmarkers CD18, gemessen direkt nach Inkubationsende (Stunde 0), liegt im Mittel bei 89 % und die Expression des Oberflächenmarkers CD45low bei 4%. Zwei Stunden nach Inkubationsende wurde eine 30 % geringere CD18-Expression im Vergleich zur Stunde 0 gemessen (mw = 60,3 %), wobei die Messwerte einer größeren Streuung unterlagen. Die mit OND-inkubierten Zellen exprimierten CD18 zu ca. 20 % weniger als die mit R252-inkubierten Zellen und die Ktr (Tab. 5). Im Vergleich zur Stunde 2 stieg vier Stunden nach Inkubationsende die CD18-Expression um 29,4 % bei den OND-inkubierten Zellen und um 22,5 % bei den R252-OND-inkubierten Zellen an, während bei der Ktr die CD18-Expression um 2,9 % sank. Sechs Stunden nach Inkubationsende sank die CD18-Expression in der Ktr sowie bei den R252-inkubierten Zellen um ungefähr 20 %, nur bei OND-inkubierten Zellen sank die Prozentzahl der CD18-exprimierenden Zellen um 2,3 %.
Bei Betrachtung der vier Messzeitpunkte ist die CD45low-Expression der Zellen nicht durch die Infektion mit den Virusstämmen beeinflusst worden, da der Prozentsatz der CD45low-positiven Zellen in allen Gruppen (Ktr, OND, R252) über die gesamte Zeitspanne ungefähr gleich blieb (mw = 3,9 %, + 3,6 %, - 1,3 %).
Zusammenfassend wurde festgestellt, dass die Zellen aus der Ktr direkt nach Inkubationsende zu 90 % CD18 exprimierten, es aber im Verlauf der sechs Stunden zu einem Abfall der CD18-Expression um 44,5 % kam. Die Prozentzahl der CD18-exprimierenden Zellen bei den OND- und R252-inkubierten Zellen sank zwar
59
auch über den Zeitraum von sechs Stunden ab, allerdings nur um 15,1 % bei den OND- und 18,4 % bei den R252-inkubierten Zellen.
Um nachzuweisen, dass eine Infektion der Mikrogliazellen mit dem R252- oder dem OND-Stauvirusstamm stattgefunden hat, wurde zudem jeweils eine Untersuchung auf Staupevirusantigen durchgeführt. Direkt nach Inkubationsende (Stunde 0) konnte bei keinem Ansatz CDV-Ag nachgewiesen werden. Bei den Mikroglia, die mit dem demyelinisierenden Virusstamm R252 inkubiert wurden, konnte zwei Stunden nach Inkubationsende in 2,3% der isolierten Mikroglia Staupevirusantigen intrazellulär nachgewiesen werden. Vier Stunden nach Inkubationsende stieg diese Zahl auf 2,8 % und 6 Stunden nach Inkubation auf 4,3 %. Bei den Mikroglia, die mit dem Virusimpfstamm Onderstepoort inkubiert wurden, konnte zu keinem Zeitpunkt der Messungen CDV-Ag detektiert werden.
Die Ergebnisse dieses Versuchs beantworten die Fragestellung insoweit, dass keine ausreichende Infektion der isolierten Mikroglia - weder mit dem Impfstamm Onderstepoort, noch mit dem demyelinisierenden Virusstamm R252 - erzielt werden konnte. Die Expression von CD18 und CD45low der isolierten Mikroglia waren jedoch über die gesamte Versuchszeit ausreichend hoch, so dass der Fokus des Untersuchungszeitraums auf die Stunden nach Inkubationsende richtig gewählt war.
Um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse des vorherigen Versuchs zu überprüfen, wurde der gleiche Versuchsansatz mit Isolation der Mikrogliazellen mittels Dichte-gradientenzentrifugation und anschließender MACS-Separation und Kultivierung mit MM-prf angewendet. Aus 60,4 g Gehirnmaterial eines Hundes wurde eine Zellzahl von 1,7 x 106 Zellen/ml isoliert. Vor der Infektion mit den Virusstämmem R252 und Onderstepoort wurden die Oberflächenmarker CD11b, CD18 und CD45 gemessen.
Bei den isolierten Zellen lag die Expression des Oberflächenmarkers CD11b bei 60,8
%, während 91,6 % CD18- und 19,2 % CD45low positiv waren.
Anschließend wurden die Zellen in drei Versuchsansätze aufgeteilt und wie im vorherigen Versuch mit 0,1 MOI des Impfstamms Onderstepoort oder mit 0,1 MOI des Virusstamms R252 infiziert. Zu den Zellen der Negativkontrolle wurde HBSS-Lösung hinzugefügt. Die Expression des Oberflächenmarkers CD18 wurde direkt nach Inkubationsende (Stunde 0), 2, 4 und 6 Stunden nach Inkubationsende mit dem Durchflusszytometer gemessen (Tab. 6).
60
Tabelle 6: Anteil der CD18-exprimierenden Zellen direkt nach Inkubationsende, 2, 4 und 6 Stunden nach Inkubationsende.
Infektion der Zellen
CD18-Expression
Stunde 0 Stunde 2 Stunde 4 Stunde 6
HBSS (Ktr) 96,6 % 70,5 % 86 % 47,7 %
OND 98,4 % 94,5 % 95,2 % 70,5 %
R252 94,6 % 94,5 % 91,6 % 90,9 %
Direkt nach Inkubationsende (Stunde 0) exprimierten die isolierten Zellen CD18 zu 96,5 % (mw aller Versuchsansätze) unabhängig davon, ob sie mit R252, OND oder HBSS inkubiert wurden. Die mit R252 inkubierten Zellen zeigten kaum eine Veränderung in Bezug auf die Expression von CD18 im weiteren zeitlichen Verlauf und wiesen auch 2, 4, und 6 Stunden nach Inkubation eine Expression von über 90 % auf. Die mit OND inkubierten Zellen exprimierten CD18 in den ersten 4 Stunden nach Inkubationsende relativ konstant zwischen 94,5 % - 98,4 %, während nach 6 Stunden ein Abfall auf 70,5 % zu verzeichnen war. Die CD18-Expression der Ktr sank allerdings über die folgenden sechs Stunden im Vergleich zu den anderen Virusstämmen, so dass zum letzten Messzeitpunkt nur noch 47,7 % der Zellen CD18+ waren.
Der intrazelluläre Nachweis des Staupevirusantigens wurde zu den oben bereits erwähnten Messzeitpunkten direkt nach Inkubationsende, sowie 2, 4 und 6 Stunden nach Inkubationsende gemessen. Bei der Ktr, aber auch bei den Zellen, die mit dem Impfstamm Onderstepoort inkubiert wurden, konnte zu keinem Messzeitpunkt CDV-Ag detektiert werden. Somit fand keine Infektion mit dem Onderstepoort statt. In der Zellpopulation, die mit dem R252 Virusstamm inkubiert wurde, konnte direkt nach Inkubationsende in 5,1 % der Zellen CDV-Ag nachgewiesen werden, 2 und 4 Stunden nach Inkubationsende wurde das CDV-AG in 6 % bzw. 5,8 % der Zellen detektiert. Sechs Stunden nach Inkubationsende wurde in 21,7 % der Zellen CDV-Ag detektiert. Somit konnte eine Infektion der Zellen mit dem Virusstamm R252 nachgewiesen werden, welche 6 Stunden nach Inkubationsende am höchsten war.
Als Resultat der unterschiedlichen Fragestellungen kann festgehalten werden, dass für das Gewinnen einer möglichst reinen Population kaniner Mikroglia aus
61
Gehirnmaterial die Methode der Dichtegradientenzentrifugation mit anschließender MACS-Separation die besten Ergebnisse lieferte. Für die Kultivierung der Mikroglia in Reinkultur konnten bessere Ergebnisse mit dem Kulturmedium MM-prf erzielt werden im Vergleich mit dem Sato-Medium. Die Kultivierung von Mikrogliazellen in der Reinkultur stellt sich als sehr schwierig da und es war nicht möglich, die Zellen länger als 24 Stunden in der Kultur zu halten. Eine Infektion der kultivierten Mikrogliazellen mit dem Staupevirusstamm Onderstepoort war nicht erfolgreich, mit dem Virustamm R252 war jedoch eine Infektion nachweisbar, die nach 6 Stunden Inkubation die höchste Infektionsrate aufwies.
Die Zellzahl der R252-infizierten Mikroglia war nicht ausreichend hoch, um ihr Reaktionsprofil nach Infektion mit CDV zu evaluieren. Neben der Aktierung der Mikroglia werden auch Monozyten aus dem peripheren Blut in das ZNS rekrutiert (WISNIEWSKI et al. 1972; GRIOT-WENK et al. 1991a, b). Sobald die Monozyten in das ZNS eingewandert sind, ist eine Differenzierung von der ansässigen Mikroglia schwer möglich. Ihr funktionalen Eigenschaften, wie die Produktion von ROS, Antigen-Präsentation und Phagozytose sind vergleichbar mit denen der Mikroglia, jedoch ist ihr Einfluß auf die Pathogenese der CDV-Infektion nicht bekannt. Zur Evaluierung ihres Einflusses auf das Immunsystem im Rahmen der akuten Staupevirusinfektion wurden im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit Monozyten aus dem peripheren Blut in vitro mit dem Onderstepoort und dem R252-Staupevirusstamm infiziert und ihre ROS-Produktion und CD14-Expression zu evaluiert.
62
4.2 REACTIVE OXYGEN SPECIES PRODUCTION IS SUPPRESSED