Die Pathogenese der Demyelinisierung bei der akuten Staupevirusinfektion beim Hund ist noch nicht abschließend geklärt, jedoch wird den Mikroglia eine entscheidende Rolle zugesprochen (STEIN et al. 2004b). Im Rahmen der CDV-Infektion werden Monozyten ins ZNS rekrutiert, um die Immunabwehr zu unterstützen (WISNIEWSKI et al. 1972; GRIOT-WENK et al. 1991a, b). Welchen Einfluss allerdings die rekrutierten Monozyten aus dem peripheren Blut auf die Entstehung der Demyelinisierung haben, ist bis dato nicht bekannt. Um zur Aufklärung dieser Fragestellung beizutragen, wurden in der vorliegenden Arbeit zum einen die Methodik zur Isolierung und Kultivierung kaniner Mikroglia untersucht und zum anderen in vitro CDV-infizierte Monozyten des peripheren Blutes charakterisiert.
Das Ziel im ersten Teil der vorliegenden Arbeit war, die Methode zur Isolierung kaniner Mikroglia nach Stein et al. (2004a) an nicht-pathologisch veränderten Gehirnen anzuwenden und zu optimieren, um eine Mikroglia-Reinkultur zu etablieren.
Eine Reinkultur von Mikrogliazellen würde die Bearbeitung weiterer Fragestellungen ermöglichen, in denen gezielte Versuche zum Reaktionsprofil der Mikroglia ohne Einfluss anderer Zellen durchgeführt werden könnten.
Zur Bearbeitung der Fragestellung eines optimierten Isolationsprotokolls zum Erlangen einer möglichst reinen Mikrogliapopulation wurden die Isolationsmethoden der Dichtegradientenzentrifugation und MACS-Separation angewendet und die Ergebnisse verglichen. Hierbei zeigte die Mikrogliapopulation, die mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert wurde, eine deutlich höhere Reinheit als die, die mittels MACS-Separation gewonnen wurde. Dafür war mit der MACS-Separation eine geringgradig höhere Zellzahl zu verzeichnen. Aufgrund der Ergebnisse des ersten Versuchs wurde bei dem darauf aufbauenden Versuch eine Dichtegradientenzentrifugation mit anschließender MACS-Separation angewendet und das Resultat mit der Isolationsmethode MACS-Separation verglichen. Durch eine Kombination beider Isolationsmethoden, der Dichtegradientenzentrifugation mit einer anschließenden MACS-Separation, wurde neben einer höheren Gesamtzellzahl zudem ein höherer Anteil CD11b+, CD45low+ und CD18+ Zellen gewonnen, was auf
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eine höhere Reinheit der isolierten Mikrogliapopulation hinweist, als durch eine Isolationmethode allein erreicht werden konnte.
Die so gewonnene Mikrogliapopulation wurde zur Bearbeitung der nächsten Fragestellung nach der Verwendung des optimalen Zellkulturmediums in zwei verschiedenen Medien kultiviert und Unterschiede zwischen den Medien evaluiert.
Die Kultivierung der Mikrogliazellen in Sato-Medium + m-csf resultierte in einer deutlich reduzierten Vitalität und Reinheit im Vergleich zu dem MM-prf-Kulturmedium.
Ein weiterer Vorteil dieses Mediums stellt die deutlich längere Haltbarkeit und die wesentlich leichtere Herstellung dar, wodurch das Risiko für Kontaminationen verringert wird. Jedoch zeigte sich im zeitlichen Verlauf der Kultivierung ein starker Abfall der CD11b+, CD45low+ und CD18+ Zellen und wies darauf hin, dass die Auswahl des Mediums noch zu optimieren ist, um die Mikrogliazellen länger in Kultur halten zu können. Die hier angewendeten Konditionen erlaubten lediglich eine Untersuchung der Mikroglia innerhalb des ersten Tages in Kultur.
Eine Studie hat gezeigt, dass Mikrogliazellen in der Mischkultur ein sehr gutes Wachstum aufwiesen, allerdings auch dort an Tag drei nicht mehr nachweisbar waren (ORLANDO et al. 2008). Auch die während der oben beschriebenen Versuche erhobenen Ergebnisse zeigen, dass die Erhaltung der Mikroglia in Reinkultur mit einem hohen Schwierigkeitsgrad assoziiert ist und dass sie nach einem Zeitraum von zwei Tagen eine hohe Mortalität aufweisen. Unter den bisher untersuchten Versuchsbedingungen ist daher eine Evaluierung der Mikrogliazellen in Kultur nur innerhalb des ersten Tages möglich. Im Vergleich der Kulturmedien hat das Medium MM-prf im Vergleich zu dem Sato-Medium (+/- m-csf) bessere Ergebnisse in Bezug auf das Zellwachstum und die Vitalität geliefert, deshalb ist das Medium MM-prf für weitere Versuche mit Kultivierung von Mikroglia zu empfehlen.
Die Bearbeitung der dritten Arbeitsaufgabe, Mikrogliazellen in vitro mit R252 oder OND zu infizieren, brachte ein unterschiedliches Ergebnis in Abhängigkeit davon, welcher Virusstamm verwendet wurde. Während der attenuierte OND nicht in Mikroglia nachgewiesen werden konnte, war der demyelinisierendeR252-Virusstamm befähigt, Mikrogliazellen bis zu 27 % zu infizieren. Laut Literatur ist eine Infektion der Mikroglia zu 100 % mit dem R252-Virusstamm möglich, wobei der Virusstamm OND
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nur 1 % der Mikroglia infizierte (ORLANDO et al. 2008). Allerdings wurden bei diesen Versuchen die isolierten Mikroglia in einer Mischkultur gehalten und die Ergebnisse nicht im Durchflusszytometer, sondern mittels immunzytologischer Untersuchung erhoben. Bei den Mikrogliainfektionsversuchen der vorliegenden Arbeit könnte somit die Infektion mit dem OND unterhalb des Detektionslimit der Durchflusszytometrie gelegen haben.
Bei der Arbeit von Stein et al (2004a) wurde eine höhere Gesamtzellzahl und Reinheit der Mikroglia durch alleinige Dichtegradientenzentrifugation erzielt als in dieser Studie. Allerdings wurden in oben genannter Arbeit junge Hunde in einem Alter von ca. 6 Monaten verwendet und es ist bekannt, dass die Isolation der Mikroglia junger Tiere deutlich bessere Resultate als die bei älteren liefert (STEIN et al. 2004a). Zudem wurde die Mikroglia aus in vivo CDV-infizierten Hunden isoliert, während in vorliegender Studie Mikroglia aus dem Gehirn von Hunden ohne pathologische Veränderungen isoliert wurden. Im Gehirn von Hunden ohne pathologische Veränderungen sind ruhende Mikroglia vorhanden, welche sich mit ihren Zellausläufern in der Umgebung verankern (MATTHEWS u. KRUGER 1973a, b). Es wird vermutet, dass sich die ruhende ramifizierte Mikroglia schlechter von der Umgebung lösen und somit isolieren lässt, als aktivierte Mikroglia ohne Zellausläufer (MORI u. LEBLOND 1969). Zudem führt eine Aktivierung nicht nur zu einer Veränderung der Morphologie, sondern auch zu einer erhöhten Proliferationsbereitschaft und zur Rekrutierung von Monozyten aus dem Blut, welche nach ihrer Einwanderung in das ZNS kaum mehr von Mikroglia unterschieden werden können (DIJKSTRA et al. 1985). Demnach ist es nicht erstaunlich, dass bei der Arbeit von Stein et al (2004a) eine höhere Gesamtzellzahl und Reinheit der Mikroglia nach der Isolation mittels Dichtegradientenzentrifugation erzielt werden konnte.
Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit befasst sich mit der Charakterisierung von in vitro CDV-infizierten Monozyten aus dem peripheren Blut. Es konnte gezeigt werden, dass die ROS-Produktion kaniner Mikroglia zur Pathogenese der Demyelinisierung bei der akuten Staupevirusinfektion beitragen kann (STEIN et al. 2004b). Im Rahmen der Infektion wandern Monozyten in das ZNS ein, um die dort ansässige Mikroglia bei der Immunabwehr zu unterstützen
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(WISNIEWSKI et al. 1972; GRIOT-WENK et al. 1991b, a). Es ist jedoch noch nicht geklärt, welchen Einfluss die CDV-Infektion auf die Monozyten ausübt und welche Konsequenzen sich daraus für die Entstehung demyelinisierender Läsionen nach deren Rekrutierung ins ZNS ergeben.
Um den Einfluss der Monozyten auf die Entstehung der Viruspersistenz und den Demyelinisierungsprozess bei der akuten Staupevirusinfektion zu evaluieren , ist eine Charakerisierung der Monozyten anhand ihrer ROS-Produktion und CD14-Expression nötig. Die isolierten Monozyten konnten mit beiden Virusstämmen, OND und R252, infiziert werden, jedoch war das Reaktionsprofil der infizierten Monozyten in Abhängigkeit von dem infizierenden Virusstamm sehr unterschiedlich.
Der demyelinisierende R252-Stamm infizierte signifikant mehr Monozyten als der OND, zudem war in den R252-infizierten Monozyten auch quantitativ signifikant mehr CDV-Ag nachweisbar, als in den OND-infizierten Monozyten. Beide Virusstämme lösten bei den infizierten Monozyten im Vergleich zu den nicht-infizierten Monozyten eine ähnliche Aufregulation des Oberflächenmarkers CD14 und dessen Expressionsintensität aus. Diese Ergebnisse untermauern die Resultate der in vitro Versuche von Stein et al. (2008), in denen gezeigt wurde, dass die Mikroglia der Hunde mit schweren neurologischen Symptomen und einer Demyelinisierung im ZNS CD14 nur zu 54 % exprimieren, wobei die Mikroglia der Hunde mit geringgradigen neurologischen Symptomen ohne Demyelinisierung im ZNS zu 74 % CD14+ waren.
Generell können Viren das angeborene Immunsystem über den Signalweg aktivieren (ROLLAND et al. 2006). Die Aktivierung des CD14/TLR4-Signalwegs könnte also zu einer frühzeitigen Elimination des Virus führen und somit die Viruspersistenz verhindern. Die hochgradig R252-infizierten Monozyten lösen allerdings im Verhältnis zu den geringgradig OND-infizerten Mikroglia eine geringere Expression von CD14 aus, was einen Mechanismus zur Entstehung einer Viruspersistenz darstellen könnte.
Mittels Dichtegradientenzentrifugation wurden Monozyten aus dem peripheren Blut isoliert und kultiviert. Die Monozyten wurden anschließend mit zwei Staupevirusstämmen infiziert, zum einen mit dem demyelinisierenden R252-Virusstamm und zum anderen mit dem Impfstamm OND. Die Virusinfektion der Monozyten stimulierte diese, ROS zu produzieren. Das Ausmaß der Produktion war jedoch von dem infizierenden Virusstamm abhängig. Interessanterweise waren die
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Anzahl ROS-produzierender Monozyten und die ROS-Bildungsintensität bei den OND-infizierten Monozyten höher als bei den R252-infizierten. Die nicht-infizierte Negativkontrolle produzierte die größte Menge ROS. Die ROS-Generation CDV-infizierter Monozyten lag somit unterhalb des Potentials gesunder, nicht-infizierter Monozyten. Ein Vergleich der ROS-Produktion in vivo infizierter Mikroglia (STEIN et al. 2004b) mit in vitro infizierten Monozyten verdeutlicht, dass das Potential der Monozyten erheblich oberhalb dessen der Mikroglia liegt. Da Monozyten im Rahmen der CDV-Infektion ins ZNS rekrutiert werden und dort ihr ROS-Bildungspotential entfalten, können sie entscheidend an der Pathogenese der Demyelinisierung beteiligt sein und vermutlich in größerem Maße als die Mikroglia für den Schaden im ZNS verantwortlich sein.
Die gewonnenen Ergebnisse können neue Therapieansätze bei der akuten Staupevirusinfektion ermöglichen, da durch das Verhindern der Einwanderung von Monozyten ins ZNS die Pathogenese der Demyelinisierung entscheidend beeinflusst und verhindert oder zumindest vermindert werden könnte. Versuche mit Cannabinoiden zeigen erfolgsversprechende Resultate in Bezug auf eine Verhinderung der Einwanderung von Monozyten in das ZNS (SADATIPOUR et al.
1998; HENDRIKS et al. 2004), welche somit eine Therapiestrategie darstellen könnten.
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Zusammenfassung
Maren Martin: Untersuchungen über den Einfluss der akuten Staupevirusinfektion auf die Funktion ex vivo kultivierter kaniner Monozyten
In der akuten Phase der Infektion mit dem kaninen Staupevirus (CDV) kommt es bei der neurologischen Verlaufsform klassischerweise zu einer Immunsuppression gefolgt von einer Demyelinisierung in der weißen Substanz des zentralen Nervensystems (ZNS). Die Pathogenese der Demyelinisierung ist nicht abschließend geklärt, jedoch werden verschiedene Hypothesen postuliert. Zum einen kann der Zellmetabolismus der Oligodendrozyten durch eine CDV-Infektion direkt gestört werden, woraus eine Schädigung des Myelins resultiert (primäre Demyelinisierung).
Zum anderen führt die CDV-Infektion zu einer Aktivierung der Mikroglia, welche als einen Mechanismus der unspezifischen Immunabwehr reaktive Sauerstoffspezies (ROS) produziert. Oligodendrozyten sind besonders empfindlich gegenüber ROS und können als innocent bystander geschädigt werden, was ebenso zu einem Myelinschaden führen kann (sekundäre Demyelinisierung). Eine weitere vom Immunsystem initiierte Reaktion bei der CDV-Infektion ist die Rekrutierung von Monozyten aus dem peripheren Blut ins ZNS, wo sie sich zu Makrophagen wandeln.
Sobald die Monozyten in das ZNS eingewandert sind, ist eine Differenzierung von der dort ansässigen Mikroglia schwierig. Daher ist nicht sicher zu bestimmen, was den Ursprung der ROS-Produktion darstellt, da die eingewanderten Monozyten genauso wie die Mikroglia zur ROS-Produktion befähigt sind und somit auch einen Beitrag zur Pathogenese der sekundären Demyelinisierung leisten können. Demnach war das Ziel dieser Arbeit die Hypothese zu belegen, dass CDV-infizierte Monozyten ROS produzieren und dass das Ausmaß dieser Produktion vom Virusstamm abhängig ist und somit den Einfluss auf das Immunsystem widerspiegelt.
Desweiteren sollte die Isolation der Mikroglia optimiert werden, um eine Reinkultur mit Mikroglia für die Bearbeitung weiterer Fragestellungen zu etablieren. Zur Optimierung der Mikroglia-Isolation wurden verschiedene Protokolle angewendet und deren Effektivität mittels der Expression von CD11b, CD18 und CD45low durchflusszytometrisch bestimmt. Die Dichtegradientenzentrifugation mit
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anschließender MACS-Separation lieferte die höchste Zellzahl mit der höchsten Reinheit und Vitalität der isolierten Mikroglia. Desweiteren sollten die Bedingungen definiert werden, die es erlauben, Mikroglia in Reinkultur zu halten. Dazu wurden zwei Medien, Microglia Medium (MM-prf) und Sato-Medium jeweils mit und ohne Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (m-csf), verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass eine Kultivierung im MM-prf-Kulturmedium eine höhere Gesamtzellzahl, Reinheit und Vitalität der Mikroglia erzielte als im Sato-Medium.
Dennoch wiesen die Mikroglia in der Reinkultur nach 24 Stunden eine sehr hohe Mortalitätsrate auf. Daher konnte eine Untersuchung der Mikroglia nur innerhalb der ersten 24 Stunden durchgeführt werden. Zur Untersuchung, ob Mikrogliazellen in vitro mit CDV infiziert werden können, wurden sie mit zwei verschiedenen Virusstämmen, dem attenuierten Onderstepoort (OND) und dem virulenten R252-Stamm, inkubiert. Interessanterweise konnte eine Infektion der Mikroglia mit dem R252 durchflusszytometrisch nachgewiesen werden, während eine Infektion mit dem Impfstamm OND nicht nachgewiesen werden konnte.
Zur Untersuchung der Monozyten wurde 10 ml Vollblut von zehn gesunden Beaglen entnommen und die Monozyten mittels Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Die Monozyten wurden anschließend kultiviert und mit dem Impfstamm OND oder dem R252-Virusstamm infiziert und mit nicht-infizierten Monozyten als Negativkontrolle verglichen. Der Nachweis intrazellulären CDV-Antigens, die Expression von CD14 und die ROS-Produktion wurden direkt nach der Infektion (p.i.) und nach drei Stunden Inkubation (3 h p.i.) im Durchflusszytometer gemessen. Anders als bei der Mikroglia war eine Infektion der Monozyten mit beiden Virusstämmen möglich, wobei der R252 signifikant mehr Monozyten infizierte und zudem einen signifikant höheren virus load der Monozyten aufwies. Bei den CDV-infizierten Monozyten waren sowohl die Expression des Oberflächenmarkers CD14 als auch die Expressionsintensität im Vergleich zur nicht-infizierten Negativkontrolle signifikant aufreguliert. Neben einer Aufregulation von CD14 stimulierte die CDV-Infektion die Monozyten zur Generation von ROS, wobei interessanterweise die R252-infizierten Monozyten weniger ROS produzierten als die OND-infizierten und die nicht-infizierte Negativkontrolle.
Monozyten können das angeborene Immunsystem über den CD14/TLR4-Signalweg aktivieren und eine frühzeitige Elimination des Virus bewirken. Die hochgradig R252-infizierten Monozyten zeigten jedoch im Vergleich zu den geringgradig
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infizierten Monozyten eine geringere Expression von CD14, was einen Mechanismus zur Entstehung einer Viruspersistenz darstellen könnte. Die ROS-Generation von CDV-infizierten Monozyten kann entscheidend zur Pathogenese der Demyelinisierung beitragen.
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Summary
Maren Martin: Investigation about the influence of acute canine distemper virus infection on the function of ex vivo cultivated canine monocytes
The acute phase of canine distemper virus (CDV) infection is characterized by immunosuppression and demyelination in the white matter of the central nervous system (CNS). The pathogenesis of demyelination is still poorly understood.
However, different hypotheses are postulated of which one sees a disturbance in the metabolism of the oligodendrocytes by the CDV infection as causative as it leads to damage of the myelin sheaths (primary demyelination). Another hypothesis considers microglial activation due to the CDV infection as a central role. Activated microglia generates reactive oxygen species (ROS) as a mechanism of the non-specific immunity. Since oligodendrocytes are highly vulnerable to ROS they can be damaged as innocent bystanders and consequently also the myelin sheath will be damaged (secondary demyelination). Another mechanism initiated by the immune system is the recruitment of peripheral blood monocytes into the CNS. After the monocytes entered the CNS they change into tissue macrophages and their differentiation from microglia is complicated. As both, microglia and the invading monocytes are capable to generate ROS its source is indistinguishable. Therefore, monocytes could also play an important part in the pathogenesis of secondary demyelination. The aim of this study was to evaluate the ROS generation of peripheral blood monocytes in response to CDV infection as this can reflect the activation of the immune system. Moreover, the aim was to optimize the isolation protocol of microglia in order to establish a pure micoglia cell culture for further research on microglial reaction profile.
For optimizing the microglia isolation different protocols were applied and their effectivities were determined via the cells’ expression of CD11b, CD18 und CD45low using flow cytometry. Density gradient centrifugation with subsequent MACS separation revealed the highest cell yield, purity and vitality of the isolated microglia population. Additionally, the conditions had to be established that allow cultivation of a pure microglia cell culture. Therefore, two culture media, Microglia Medium
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(MM-prf) and Sato-Medium each with and without macrophage colony-stimulating factor (m-csf) were compared. It could be demonstrated that microglial cultivation with MM-prf media leads to a higher cell yield, purity and vitality compared to Sato-Medium. Nevertheless, the mortality rate of the microglia was very high after 24 hours in culture. Therefore, microglial characterization had to be performed within the first 24 hours of culturing. Two CDV strains, the virulent R252 strain and the attenuated Onderstepoort (OND), were used to test whether microglia could be infected in vitro. Interestingly, only the R252 could be detected in microglia whereas no infection could be confirmed with OND.
For the characterization of monocytes 10 mL of whole blood was collected from 10 healthy Beagle dogs and isolated using density gradient centrifugation. The monocytes were cultured and infected with either the vaccine strain OND or the demyelinating strain R252 and the results of their characterization compared to that of non-infected monocytes that served as negative control (ctr). The intracellular CDV-antigen, the expression of CD14, and the ROS production were measured using flow cytometry directly post infection (p.i.) and three hours post infection (3 h p.i.). In contrast to the trial with microglia both virus strains were able to infect the isolated monocytes. However, the R252 strain infected significantly more monocytes with a significantly higher virus load compared to OND. The CDV-infected monocytes showed a significant up-regulation of the CD14 expression and expression intensity compared to the non-infected controls. Moreover, the CDV infection stimulated the monocytes to generate ROS. Interestingly, the R252-infected monocytes generated less ROS than the OND-infected and the non-infected monocytes.
Monocytes can activate the innate immunity via the CD14/TLR4 signaling pathway and eliminate the virus early in the course of the disease. However, the severely R252-infected monocytes showed a distinctly lower CD14 expression than the OND-infected monocytes which might represent a mechanism for the development of virus persistence. The ROS generation of CDV-infected monocytes may have an essential role in the pathogenesis of demyelination.
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