Methodik zur Charakterisierung kaniner Monozyten

Den Hunden wurde 10 ml Vollblut durch die Punktion der V. cephalica antebrachii und/oder V. saphena lateralis entnommen und in einem EDTA-Röhrchen aufgefangen. Anschließend wurde die Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt.

Dazu wurden 2 ml Histopaque in ein 15 ml Röhrchen pipettiert und mit 5 ml Pancoll der Dichte 1,077 g/ml überschichtet, gefolgt von maximal 6 ml in PBS verdünntem Vollblut (Verdünnung 1:1). Um 10 ml Vollblut zu verteilen wurden vier Gradienten gegossen, welche bei 700 x g für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert wurden. Nach dem Zentrifugieren haben sich die Zellen entsprechend ihrer Dichte auf den verschiedenen Schichten angesammelt. Die Interphase zwischen dem Plasma und dem Pancoll bestand aus der Akkumulation mononukleärer Zellen.

Diese Zellschicht wurde abpipettiert und dreimal mit HBSS-Lösung gewaschen und zweimal bei 170 x g und einmal bei 250 x g für zehn Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Falls das Zellpellet mit Erythrozyten kontaminiert war, wurde eine hypotone Lyse durchgeführt. Bei der hypotonen Lyse wurde das Zellpellet mit 5 ml Aqua dest. für 20 Sekunden resuspendiert und danach mit 5 ml doppelt konzentriertem PBS aufgefüllt und bei 170 x g für 5 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach dem letzten Waschschritt wurde der Überstand verworfen und das Monozyten-Zellpellet in CellWash resuspendiert. Die Anzahl der lebenden Zellen wurde mittels Zählkammer nach Türk bestimmt.

Staupevirusinfektion

Die isolierte Monozyten-Zellsuspension wurde gedrittelt und jeweils in ein 15 ml Röhrchen gegeben. Ein Röhrchen wurde mit 0,1 multiplicity of infection des CDV-Impfstamms Onderstepoort und das andere mit 0,1 multiplicity of infection des virulenten Staupevirusstamm R252 versetzt. In dem dritten Röhrchen wurden die Monozyten mit HBSS-Lösung versetzt und dienten als Negativkontrolle. Nach einer Stunde im Inkubator bei einer konstanten Temperatur von 37 °C und einem CO2-Gehalt von 5 % wurden die Zellen dreimal mit HBSS-Lösung gewaschen und jeweils für zehn Minuten bei 170 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach der Infektion wurden die Zellen der verschiedenen Versuchsansätze (Ktr, Ond und R252)

48

geteilt. Der erst Teil wurde direkt post infectionem (p.i.) gemessen und der zweite Teil wurde nach drei weiteren Stunden der Inkubation (3 Stunden p.i.) gemessen.

Für diese zwei Messzeitpunkte wurde jeweils die Expression des Oberflächenmoleküls CD14, das intrazelluläre CDV-Ag und die Produktion reaktiver Sauerstoffspezies für jeweils die Negativkontrolle und die OND-, bzw.

R252-infizierten Monozyten mittels FACS-Analyse evaluiert.

Durchflusszytometrie

Die Identifikation der Monozyten wurde mit der Cell-Quest-Software durchgeführt und die Populationen der Monozyten und Lymphozyten anhand ihrer Größe (forward scatter, FSC) und Komplexität (side scatter, SSC) voneinander differenziert.

Detektion des Oberflächenmoleküls CD14

Die Membran-Immunfluoreszenz wurde, wie bereits von Stein et al. (2004a) beschrieben, durchgeführt. Fc-Rezeptoren wurden mit humanem IgG geblockt, um Hintergrundfluoreszenzen zu minimieren. Danach wurde die Zellsuspension in drei Teile geteilt (Nativkontrolle, Isotypkontrolle, CD14-Teströhrchen). Die Zellsuspension der Nativkontrolle wurde mit MIF-Puffer, die Zellsuspension der Isotypkontrolle mit R-Phycoerythrin-konjugiertem Ziege-anti-Maus IgG und die Zellsuspension aus dem CD14-Teströhrchens mit direkt R-Phycoerythrin-konjugierten mononukleärer Antikörper gegen CD14 versetzt und für 20 Minuten bei 4 °C inkubiert. Nach einmaligem Waschen mit MIF-Puffer wurden die Zellen bei 300 x g für zehn Minuten bei 10 °C zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in FACSFlow mit TO-PRO-3 in einer Verdünnung von 1:1.000 resuspendiert und direkt im FACSCalibur gemessen. Pro Messung wurden insgesamt 10⁴ live-gated events pro Messung analysiert. Der cut-off wurde so gesetzt, dass nicht mehr als 2 % der Zellen der Negativkontrolle ein positives Signal zeigten.

49

Detektion des Staupevirusantigens in den Monozyten

Die intrazelluläre Identifikation des CDV in den Monozyten wurde nach den Angaben in der Literatur (CHERPILLOD et al. 2000) durchgeführt. Nach einer Fixation der Monozyten mit 4%igem Paraformaldehyd für 20 Minuten bei 4 °C wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen und jeweils bei 250 x g für zehn Minuten zentrifugiert.

Um die Zellmembran zu permeabilisieren, wurden 150 µl einer 0,03%igen PBS-Saponin-Lösung zu dem Zellpellet hinzu gegeben. Humanes IgG wurde zum Blocken des Fc-Rezeptors benutzt. Die Zellsuspensionen der drei Versuchsansätze (Ktr, OND, R252) wurden gedrittelt und in drei Röhrchen überführt (Nativkontrolle, Sekundärantikörperkontrolle und CDV-Ag-Teströhrchen). In die Nativ- und Sekundärantikörperkontrolle wurde 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung und in das CDV-Ag-Teströhrchen der gegen das Nukleoprotein gerichtete Antikörper D110 in einer Verdünnung von 1:16 hinzugefügt und für 30 Minuten bei 4 °C inkubiert.

Danach folgten zwei Waschschritte mit 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung und Zentrifugation bei 250 x g für fünf Minuten bei 10 °C. Der R-Phycoerythrin-konjugierte Sekundärantikörper Ziege-anti-Maus wurde in die Sekundärantikörperkontrolle und in das CDV-Ag-Teströhrchen hinzugefügt und erneut für 30 Minuten bei 4 °C inkubiert.

Nach zwei letzten Waschschritten mit 0,03%iger PBS-Saponin-Lösung und Zentrifugation bei 250 x g für fünf Minuten bei 10 °C, wurde das Zellpellet in FACSFlow resuspendiert und unverzüglich im Durchflusszytometer gemessen. Es wurden wiederum 10⁴ live-gated events pro Probe analysiert und der cut-off so adjustiert, dass nicht mehr als 2 % der Zellen der Negativkontrolle ein positives Signal zeigten.

Detektion der ROS-Produktion von Monozyten

Die Detektion der ROS-Produktion von Monozyten wurde, wie in der Literatur für Mikrogliazellen beschrieben durchgeführt (STEIN et al. 2004a). Pro Versuchsansatz wurden jeweils 90 µl Zellsuspension in eins von fünf Röhrchen überführt und anschließend für 15 Minuten bei 37 °C mit einem CO2 Gehalt von 5 % inkubiert.

Nach der Inkubation wurden, da der Versuch im Doppenansatz durchgeführt wurde, 10 µl PMA in zwei Röhrchen pipettiert. Phorbol Myristat Acetat triggert die ROS-Produktion in den Zellen. In die verbleibenden drei Röhrchen wurden 10 µl PBS pipettiert, wobei ein Röhrchen davon als Nativkontrolle geführt wurde. Nach einer

50

weiteren Inkubationsperiode aller Röhrchen von 15 Minuten bei 37 °C mit 5 % CO2

wurde allen Ansätzen außer der Nativkontrolle 20 µl des nicht-fluoreszierenden Dihydrorhodamin 123 zugefügt und wiederum unter den gleichen Bedingungen wie zuvor für 15 Minuten inkubiert. In dieser Zeit wandelt das von den Monozyten produzierte ROS das Dihydrorhodamin 123 (DHR) in das fluoreszierende Rhodamin 123 um. Nach der Inkubation wurden die Zellen 15 Minuten auf Eis gestellt, um die Rhodamin 123 Umwandlung innerhalb der Zellen zu stoppen. Daraufhin wurden die Zellen mit FACSFlow und TO-PRO-3 in einer Verdünnung von 1:1.000 im Durchflusszytometer gemessen. Es wurden 10⁴ live-gated events pro Probe analysiert. Der cut-off wurde in der Negativkontrolle so adjustiert, dass das Signal der Population der nicht-getriggerten Monozyten als negativ detektiert wurde. Da die Versuche im Doppelansatz durchgeführt wurden, wurden der Mittelwerte aus beiden Ergebnissen zur weiteren Analyse verwendet.