4.1 Synthese und Analyse neuartiger CD4-bindender Peptidomimetika
4.1.9 SPR-Untersuchungen der neu entwickelten Peptidomimetika
Tabelle 9: Durchgeführte, mikrowellenunterstützte Synthesen der Liganden 16-23. Es wurden jeweils 10 µmol Ansätze durchgeführt. Die Ausbeuten der Liganden sind gut, bis sehr gut.
Nr. Auswaage [mg] Ausbeute [%] Nr. Auswaage [mg] Ausbeute [%]
O O
N H
NH2
HN
O O
N H
OH O
NH O
O N O H
O O
N H
NH2
N H
O O
N H
OH O
N H
O O
N H
16 6.8 92 20 6.3 86
O O
N H
NH2
N H
O O
HN
OH O
HN O
O N O H
O O
NH NH2
N H
O O
NH OH O
N H
O O
HN
17 7.0 91 21 6.2 82
O O
NH NH2
NH
O O
NH OH O
NH O
O N O H
O O
NH NH2
NH
O O
NH OH O
N H
O O
N H
18 6.2 76 22 6.7 84
O O
N H
NH2
N H
O O
N H
OH O
N H
O O
N
O H O
O O
O N H
NH2
N H
O O
NH
OH O
N H
O O
N H O
O
19 6.5 84 23 6.2 82
Die Ausbeuten der Liganden in allen Kupplungsreaktionen waren gut, bis sehr gut. Es gelang somit eine erhebliche Steigerung der gesamten Ausbeute der Liganden.
ausgewertet. Daraus ergab sich eine Aktivität von 8% des an der Oberfläche immobilisierten CD4-Proteins von 19 fmol. Die Liganden wurden jeweils in HBS-EP-Puffer, pH = 7.4, gelöst und in Konzentrationen von jeweils 2 bis 1000 µM mit einer Kontaktzeit von 120 Sekunden bei einer Flussrate von 30 µL/min über den Chip geleitet. Vor jeder Messreihe wurde eine Pufferinjektion vorgenommen und die erhaltenen RU-Antworten der Pufferkurve von den jeweiligen Ligand-Konzentrationskurven abgezogen, um spezifisch die RU-Antworten des jeweiligen Liganden mit CD4-Protein zu erhalten. Ein typischer Konzentrationsreihen-Messverlauf ist in Abbildung 47 am Beispiel des Liganden 16 dargestellt.
Abbildung 47: Sensorgramme der Vermessung des Liganden 16 gegenüber dem immobilisierten CD4-Protein. Zu erkennen ist die schnelle on- und off-rate. Zusätzlich zu erkennen ist, dass es zu Schwankungen in den RUmax-Werten kommt.
Sehr gut zu erkennen ist eine schnelle Einstellung des Gleichgewichtszustandes (steady state) etwa 55-60 Sekunden nach Beginn der Injektion. Nach Ende der Injektion regeneriert das System in sehr viel kürzerer Zeit. Die Vermessungen der Liganden 16-23 zeigten jedoch eine Schwankung, so dass eine genaue Bestimmung der Gleichgewichtswerte erschwert wurde. Aus diesem Grund wurden die SPR-Antworten 60 Sekunden nach Injektionsbeginn bestimmt. Aus der Auftragung der jeweiligen RUmax-Werte gegen die entsprechende Konzentration der Liganden kann der KD-Wert der jeweiligen Interaktion des jeweiligen Liganden mit dem CD4-Protein nach dem one-site-binding-Modell berechnet werden.
Abbildung 48: SPR-Affinitätsanalyse des Liganden 16 bezüglich des immobilisierten CD4-Proteins. Links: Auftragung der RU-Antworten aller Messpunkte; rot dargestellt sind diejenigen RU-Antworten, die nicht nach dem one-site-binding-Modell angefittet werden können. Rechts: Messpunkte, die nach dem one-site-binding-one-site-binding-Modell angefittet werden konnten.
Aus der Abbildung 48 ist exemplarisch für Ligand 16 deutlich zu erkennen, dass die SPR-Antworten ab einer Konzentration von 100 µM einen linearen Verlauf annehmen. Dies kann auf unspezifische Wechselwirkungen des Liganden mit der Chipoberfläche bzw. Protein zurückzuführen sein. Daher wurden sie in der Berechnung des KD-Wertes nicht mit einbezogen. Diese Vermutung lässt sich zusätzlich dadurch bekräftigen, dass die erhaltenen RU-Antworten ab der Konzentration von 100 µM über dem errechneten RUmax-Wert dieses Liganden (15 RU) liegen und somit mit dem one-site-binding-Modell nicht in Einklang zu bringen sind.
Eine kinetische Analyse der Messkurven konnte mittels der Evaluationssoftware der Firma BIAcore nicht erfolgreich durchgeführt werden. Dies liegt darin begründet, dass sowohl die Assoziation als auch die Dissoziation der Liganden so schnell erfolgten, dass der mathematische Fit der Kurven nicht mit der im Programm implementierten Funktion möglich war. Die Beobachtungen der ausgeprägt schnellen Assoziation bzw. Dissoziation konnte bereits bei den von Neffe synthetisierten Liganden gemacht werden.122 Qualitativ lässt sich jedoch sagen, dass die Kinetik der Bindung der synthetisierten Liganden 16-23 sehr schnell ist, sich aber nicht quantitativ bestimmen ließ. Diese schnelle Kinetik könnte sich dadurch erklären lassen, dass die Konformation der Liganden in Lösung schon der Konformation im gebundenen Zustand entspricht bzw. sehr ähnlich ist, so dass eine schnelle Assoziation bzw.
Dissoziation des jeweiligen Liganden möglich ist.
Tabelle 10: Mittels SPR untersuchte Liganden 16-23. Alle Liganden zeigen eine höhere Bindungsaffinität zum CD4-Protein, als die nicht backbone modifizierten Analoga von Neffe.121 Ein Trend bezüglich der verwendeten Carbamatreste und der ermittelten KD-Werte lässt sich nicht eindeutig nachweisen, jedoch binden die Ethoxy-1-yl-Carbamate (19 und 23) mit KD 8.2 bzw. 7.1 µM am geringsten.
Nr. RUmax
(RUmax theor.) KD [µM] Nr. RUmax
(RUmax theor.) KD [µM]
O O
NH NH2
N H
O O
N H
OH O
N H
O O
N O H
O O
N H
NH2
N H
O O
NH OH O
N H
O O
N H
16 8.2 ± 0.3
(14.1) 6.2 ± 0.7 20 0.92 ± 0.01
(13.8) 1.5 ± 0.1
O O
NH NH2
NH
O O
HN
OH O
HN O
O NH O
O O
N H
NH2
NH
O O
NH
OH O
NH O
O HN
17 2.2 ± 0.2
(14.6) 3.6 ± 0.9 21 0.81 ± 0.02
(14.3) 3.6 ± 0.3
O O
NH NH2
NH
O O
NH OH O
N H
O O
NH O
O O
N H
NH2
NH
O O
NH OH O
NH O
O NH
18 3.1 ± 0.3
(15.6) 2.2 ± 0.5 22 1.1 ± 0.2
(15.3) 2.7 ± 0.7
O O
N H
NH2
N H
O O
N H
OH O
N H
O O
HN
O O
O O
O N H
NH2
N H
O O
N H
OH O
N H
O O
NH O O
19 1.5 ± 0.4
(14.7) 8.2 ± 1.0 23 0.9 ± 0.2
(14.4) 7.1 ± 0.8 Wie aus der Tabelle 10 zu entnehmen ist, sind die thermodynamischen Bindungskonstanten der Liganden 16-23 allesamt in einem gleichen Größenordungsbereich. Hierbei konnte mit 1.5 ± 0.1 µM die niedrigste thermodynamische Bindungskonstante beim Liganden 20 und die höchste thermodynamische Bindungskonstante beim Liganden 19 mit 8.2 ± 1.0 µM bestimmt werden. Es lässt sich jedoch keine exakte Aussage darüber treffen, inwiefern sich die Substitution im backbone-Bereich der Liganden, entweder durch die Verwendung des H2N-Val-Ψ[COCH2]-Gly-OH (Liganden 16-19) oder durch H2N-Val-Ψ[CHCH]-Gly-OH (Liganden 20-23), sich positiv oder negativ auf die thermodynamischen Bindungskonstanten auswirkt. Die thermodynamischen Bindungskonstanten der Liganden 19 und 23 sind in
beiden Substitutionsfällen am höchsten. Dies könnte dadurch begründet sein, dass durch die Verwendung des 1-Ethoxyacet-2-yl-Restes die Liganden 19 und 23 nicht mehr in der Lage sind eine stärkere hydrophobe Wechselwirkung zum Leu61 des CD4-Proteins einzugehen, wodurch die Bindung geschwächt sein könnte. Diese Vermutung, dass die Wechselwirkung des hydrophoben Restes des jeweiligen Liganden mit dem Leu61 des CD4-Proteins von essentieller Bedeutung für die Bindung des Liganden ist, lässt sich bestätigen, wenn die KD-Werte der Cyclohexyl-Derivate 17 und 21 mit denen der Adamantyl-Derivate 18 und 22 verglichen werden. Hierbei lässt sich erkennen, dass die Adamantyl-Liganden stärker binden, als die entsprechenden Cyclohexyl-Derivate. Die thermodynamische Bindungskonstante des Liganden 16 stimmt mit dieser Theorie überein, da die tert-Butyl-Gruppe einen geringeren Raumanspruch und somit eine geringere hydrophobe Oberfläche besitzt, als eine Cyclohexylgruppe. Der mit 1.5 ± 0.1 µM bestimmte KD-Wert des Liganden 20 lässt sich hingegen mit dieser Theorie nicht erklären. Eine Begründung für das Abweichen des KD-Wertes könnte sich dadurch erklären lassen, dass die generellen RU-Antworten während der Messreihen von Ligand zu Ligand abnahmen und somit die exakte Zuverlässigkeit und Vergleichbarkeit bei der Bestimmung der KD-Werte innerhalb der Messreihe nicht mehr gegeben ist. Letztendlich ist der Fit der Messpunkte der Konzentrationen 2 µM bis 20 µM für den Liganden 20 durch die Software Origin 7.5G mit einem Chi2 = 0.00013 und einem R2 = 0.99909 sehr gut.
Abbildung 49: SPR-Affinitätsanalyse des Liganden 20 bezüglich des immobilisierten CD4-Proteins. Links: Auftragung der RU-Antworten aller Messpunkte; rot dargestellt sind diejenigen RU-Antworten, die nicht nach dem one-site-binding-Modell angefittet werden können. Rechts: Messpunkte, die nach dem one-site-binding-one-site-binding-Modell angefittet werden konnten.
Die Abnahme in den RU-Antworten liegt wahrscheinlich in der Verwendung von 150 mM Phosphorsäure zur Regeneration der Chip-Oberfläche nach vollendeter Dissoziationszeit begründet. Diese Regeneration wurde in Analogie zu dem von A. Neffe durchgeführten
Biacore-Protokoll durchgeführt.122 Es scheint jedoch in diesem Zusammenhang zu einem Verlust der Aktivität des CD4-Proteins zu kommen, wodurch im Laufe der unterschiedlichen Messungen die RU-Antworten im Gesamten stetig abnahmen. Das Kontrollexperiment zur Bestätigung diese Annahme, wurde zu diesem Zeitpunkt nicht durchgeführt, anstatt dessen wurde bei darauffolgenden Messungen am BIAcore mit neuen Chips auf ein Regenerationspuls mit Phosphorsäure verzichtet.