bestimmte molekulare Systeme erhalten. Für Peptide lautet die parametrisierte Karplus-Gleichung:125
( ) ( ) ( )
3JHNH α φ =6 7. cos2 φ− ° −60 13. cosφ − ° +60 15.
Gleichung 2
Löst man diese Gleichung nach dem Winkel θ auf, so erhält man:
⎥⎥
⎦
⎤
⎢⎢
⎣
⎡ ⎟
⎠
⎜ ⎞
⎝
⎛ −
⎟ −
⎠
⎜ ⎞
⎝
± ⎛
±
°
= 6.7
5 . 1 4
. 13
3 . 1 4
. 13
3 . cos 1 60
2 J
φ ar
Gleichung 3
Aus dieser Formel geht hervor, dass die Lösung der Karplus-Gleichung nicht eindeutig ist – es können sich bis zu vier Möglichkeiten für den Diederwinkel ergeben. Diese Tatsache muss bei der Analyse der 3J-Kopplungskonstanten berücksichtigt werden. Allerdings gelten für die Winkel φ und ψ bestimmte Einschränkungen. Diese konnten von Ramachandran anhand sogenannter hard sphere Modelle gezeigt werden.127 Die sich daraus ergebenden Winkel für φ und ψ werden im Ramachandranplot dargestellt (siehe Abbildung 12).
Abbildung 12: Ramachandranplot mit den erlaubten Winkelwerten für φ und ψ.
Eine weitere Kopplung, neben den skalaren Kopplungen, ist die dipolare Kopplung. Diese Kopplung wirkt unabhängig von Bindungselektronen durch den Raum. Anhand des Nuklear-Overhauser-Effekts (NOE) lassen sich innerhalb eines Moleküls interatomare
Abstände bestimmen. Wird die Resonanz eines Protons durch das Einstrahlen eines selektiven Pulses gestört, befindet sich das beobachtete System nicht mehr in seinem thermodynamischen Gleichgewicht. Es ist nun bestrebt, unter Nutzung aller Relaxationswege wieder in das Gleichgewicht zurückzukehren. Für das Auftreten des NOEs sind hierbei dipolare Nullquanten- und Zweiquantenübergänge verantwortlich, deren Wahrscheinlichkeiten direkt von den Abständen der beteiligten Kerne abhängen.
Die NMR-Analysen erlauben zwar so die Bestimmung einer 3D-Struktur, die räumliche Darstellung des Moleküls entspricht jedoch immer dem zeitlichen Mittel aller vorhandenen Konformationen.
Um die aus den NMR-Experimenten erhaltenen Informationen in Raumkoordinaten der Atome zu überführen, wurden sogenannte distance geometry (DG) Algorithmen entwickelt128, in die die NMR-Daten als Beschränkungen (constraints) einfließen. Das in dieser Arbeit verwendete Programm DYANA129 berechnet aus Distanz- und Winkelbeschränkungen Konformationen, die den Anforderungen eines Empirical Conformational Energy Program for Peptides ECEPP-Kraftfeldes genügen.130 Durch mehrere aufeinanderfolgende Rechenzyklen werden die zunächst zufällig generierten Strukturen durch Variationen der Diederwinkel an die vorgegebenen Abstands- und Winkelbedingungen angepasst.
Zielfunktionen, die umso kleinere Werte annehmen je besser die entsprechenden Vorgaben erfüllt werden, dienen als ein Maß der Güte für die generierte 3D-Strukture. Von Nachteil ist jedoch, dass energetische Aspekte in DG-Rechnungen nicht in Betracht gezogen werden.
Um dem entgegenzuwirken, werden nach einer DG-Rechnung häufig Moleküldynamiksimulationen (MD) mit den generierten Strukturmodellen durchgeführt.
Diese Rechnungen berücksichtigen den energetischen Aspekt und liefern energetisch günstigste und den constraints genügende 3D-Strukturen.
2.2 Oberflächenplasmonenresonanz
Die Oberflächenplasmonenresonanz ist ein physikalisches Phänomen, deren Anwendung es ermöglicht, biomolekulare Interaktionen zu untersuchen. Oberflächenplasmonenresonanz ermöglicht z. B. die zeitnahe Messung von Wechselwirkungen zwischen Liganden und Rezeptoren und die Bestimmung von Bindungsaffinitäten.
Die physikalische Grundlage dieses optischen Messsystems ist hierbei das Gesetz der Totalreflexion. Das Gesetz besagt, dass bei einem Übergang vom optisch dichteren ins dünnere Medium (n2>n1) der Einfallswinkel einen bestimmten Grenzwert (αG) nicht
überschreiten kann (sin αG = n1/n2). Bei allen Einfallswinkeln α > αG tritt Totalreflexion auf und die gesamte Lichtenergie wird gemäß dem Reflexionsgesetz in das optisch dichtere Medium reflektiert. Obwohl bei diesem Vorgang kein Nettoenergieverlust zu verzeichnen ist, entsteht im optisch dünneren Medium ein sogenanntes evaneszierendes Feld. Befindet sich nun auf der Oberfläche des optisch dichteren Mediums eine dünne Schicht eines leitenden Materials, so kann das evaneszierende Feld unter bestimmten Totalreflexionswinkel mit den Elektronen der Leiterschicht in Resonanz treten und es kommt zur Anregung von Oberflächenplasmonen.131 Durch diese Resonanz wird eine deutliche Verstärkung des evaneszierenden Feldes erreicht, die als Surface Plasmon Resonance (SPR) bekannt ist.132-134 Einhergehend mit diesem Resonanzphänomen, kommt es zu einer Reduktion der Intensität des reflektierten Lichts in Form eines Dunkelfeldes. Dieser Intensitätsverlust ist nur dann beobachtbar, wenn der Wellenvektor des einfallenden Lichts und der Oberflächenplasmonen sowohl im Betrag als auch in ihrer Richtung gleich sind. Dabei ist der Wellenvektor des Oberflächenplasmons zum einen abhängig vom Brechungsindex der dünnen leitenden Schicht und zum anderen von dem des optisch dünneren Mediums.
Unter Ausnutzung dieses Phänomens gelang es der Firma Biacore (Uppsala, Schweden;
BIA: Biomolecular Interaction Analysis) zu Beginn der neunziger Jahre des letzten Jahrhunderts ein Sensorchipsystem auf dem Markt zu etablieren, welches in der Lage ist, Interaktionen von biospezifischen Oberflächen mit in Lösung befindlichen Komponenten in Echtzeit zu untersuchen.135 In diesen Messsystemen dienen Glasträger, deren Oberfläche mit einer dünnen Goldschicht beschichtet ist, als optisch dichteres Medium. Das optisch dünnere Medium wird durch eine Flusszelle repräsentiert, die oberhalb des Glasträgers lokalisiert ist.
Ein Bindungspartner wird dabei chemisch auf der Chipoberfläche immobilisiert, wohingegen der in Lösung befindliche Bindungspartner über den Chip geleitet wird. Mit einem Wechselwirkungsereignis in der Nähe der Oberfläche des Chips geht eine Erhöhung des Brechungsindex des optisch dünneren Mediums einher. Dies hat eine Änderung des Winkels der Totalreflexion zur Folge, bei der das SPR-Phänomen auftritt. Die Verschiebung des Intensitätsminimums der Totalreflexion ist somit ein für die Messungen zugrunde liegender Parameter zur Verfolgung von Bindungsereignissen auf der Oberfläche des Chips. Als Signal wird die Veränderung des SPR-Winkels in Response Units (RU) angegeben. Da die Injektion der gelösten Komponente an sich zu einer Veränderung des Brechungsindexes und damit zu einer Veränderung des RU-Wertes führt, wird neben der eigentlichen Messzelle eine Referenzzelle vermessen, auf der sich kein Immobilisat befindet. Aus der Differenzbildung
der RU-Werte beider Zellen erhält man abschließend die eigentliche Messkurve als Sensorgramm (Abbildung 13).
Die Immobilisierung der Moleküle auf der Oberfläche des Chips kann auf unterschiedliche Weise erfolgen.136 Eine der etabliertesten Methoden ist die kovalente Fixierung des Bindungspartners auf der Oberfläche. Hierfür wird auf der Goldoberfläche eine Dextranmatrix aufgebracht, die terminal eine Carboxylfunktion trägt, über die Moleküle mit freier Aminofunktion als Amide kovalent gebunden werden können. Mittels dieser Methode ist man in der Lage, nicht nur Peptide oder Proteine, sondern auch Viren137, Bakterien138 oder Zellen139 auf der Oberfläche zu immobilisieren. Ein idealisiertes Sensorgramm ist in Abbildung 13 dargestellt. Zu Beginn einer Messung wird die in Lösung gebrachte Komponente durch die Flusszelle geleitet. Kommt es zu einer Assoziation dieser Komponente mit dem an der Oberfläche immobilisierten Spezies steigt der RU-Wert an. Wird im Anschluss an die Injektion mit Puffer gespült kommt es zu einer Dissoziation der Moleküle von der Oberfläche des Chips und der RU-Wert sinkt ab. Oftmals gelingt jedoch die Wiederherstellung der Ausgangsbedingungen nur nach der Injektion einer geeigneten Regenerationlösungen.
Abbildung 13: Idealisiertes Sensorgramm einer SPR-Messung. Die Analyse des Verlaufs der Assoziation und Dissoziation mit der Zeit erlaubt die Bestimmung von kinetischen Daten (ka, kd). Aus der Konzentrationsabhängigkeit der Gleichgewichtswerte ergibt sich die thermodynamische Dissoziationskonstante KD.
Die Analyse eines Sensorgramms ermöglicht die Bestimmung sowohl kinetischer als auch thermodynamischer Daten des Bindungsereignisses. So lassen sich durch Anpassung an die Langmuir-Gleichung die Geschwindigkeitskonstante der Assoziation (ka) und die der Dissoziation (kd) ermitteln. Der erreichte Gleichgewichtszustand ermöglicht den quantitativen
Vergleich der Bindungseigenschaften zwischen unterschiedlichen Bindungspartnern. Durch das Auftragen der erlangten Sättigungswerte gegen die jeweilige Konzentration der gelösten Komponente gelangt man, unter der Annahme des one-site binding Modells (Gleichung 4), durch das Anfitten der sich ergebenen Kurve, zur thermodynamischen Dissoziationskonstanten KD:
] [
]
max [ L K
L RU RU
D+
= ⋅
Gleichung 4
Bei der angegebenen Gleichung handelt es sich bei [L] um die Konzentration der gelösten Komponente und bei RUmax um den theoretischen Sättigungswert bei unendlich hoher Ligandenkonzentration.
Als Echtzeitmethode lassen sich kinetische Daten aus den Messreihen ableiten. Die neuesten Geräte können konstante Temperaturen gewährleisten, so dass durch die Bestimmung von KD-Werten in Abhängigkeit von der Temperatur thermodynamische Daten über Enthalpie und Entropie zugänglich sind. Nichtsdestotrotz können diffusionsbedingte Massentransportlimitierungen140 oder Rückbindungsereignisse141 zu Komplikationen der Auswertung führen.
3 3 Pr P ro ob b le l e m m s s t t e e ll l lu u n n g g
Der primäre Kontakt des HI-Virus mit humanen Wirtszellen wird durch die Wechselwirkung zwischen dem viralen Oberflächenprotein GP120 und dem humanen Rezeptor CD4 vermittelt. Als Folge dieses Kontaktes kommt es zu konformativen Änderungen innerhalb des viralen GP120-Proteins, welches eine weitere Wechselwirkung dieses Proteins mit humanen Corezeptoren und dann die Fusion des HI-Virus mit seiner Wirtszelle ermöglicht. Die Entwicklung von Inhibitoren dieser primären Wechselwirkung könnte ein vielversprechender Weg in der HIV-Therapie sein.
Basierend auf einem Virus neutralisierenden Dekapeptid114 konnten mittels STD-NMR- und in silico-Methoden CD4-bindende Peptidomimetika entwickelt und synthetisiert werden.122 Die mittels STD-NMR und SPR bestimmten Dissoziationskonstanten vom CD4-Protein für das beste Peptidomimetikum war 6 µM.121 Mittels proteolytischem Verdau konnte gezeigt werden, dass diese Peptidomimetika eine drei- bis vierfache höhere proteolytische Stabilität gegenüber Pronase besitzen als das Dekapeptid. Zur weiteren Steigerung der proteolytische Stabilität konnten ich in meiner Diplomarbeit dipeptid-mimetische Bausteine entwickeln, die zu backbone-modifizierten Peptidomimetika führten (Abbildung 14).142
NH NH O
OH Val-Gly
Dipeptidmimetikum Linker hydrophob
NH
NH2
O O
O
K T Alaninol
2-NOA
Abbildung 14: Struktur des Peptidomimetikum-Templats mit zentralem Valin-Glycin-Dipeptidmimetikum und variablem hydrophoben Rest.
Im Rahmen dieser Arbeit war es das Ziel, zunächst die oben erwähnten unterschiedlich backbone-modifizierten Peptidomimetika (Abbildung 14) in Docking-Studien mit bereits in silico gedockten, Statin-modifizierten, CD4-bindenden Peptidomimetika122 zu analysieren. Im Anschluss an diese in silico-Analyse war eingeplant, die backbone-modifizierten Peptidomimetika des obigen Typs darzustellen. Darauffolgend soll eine Optimierung der Synthesesequenz durchgeführt werden und die Bindungsaffinität mittels SPR-Bindungsstudien ermittelt werden. Ebenfalls soll der Einfluss der unterschiedlichen
dipeptid-mimetischen Modifikationen auf die proteolytische Stabilität gegenüber Pronase untersucht werden. Weiterhin war es Ziel, auf Basis der Struktur des GP120-Proteins neue peptidomimetische Verbindungen mittels NMR-spektroskopischen- und in silico-Methoden zu entwickeln, deren Bindungseigenschaften besser sind als die der Peptidomimetika des abgebildeten Typs (Abbildung 14).
Die synthetisierten Verbindungen sollten mit Hilfe von MALDI-TOF-Spektrometrie und NMR-Spektroskopie charakterisiert, sowie ihre Bindungsaffinität gegenüber dem CD4-Protein mit SPR quantifiziert werden.
4 4 Er E rg ge e b b ni n is ss se e u u nd n d D D is i s k k u u ss s si io o n n
4.1 Synthese und Analyse neuartiger CD4-bindender