Analyse und Optimierung der Festphasenpeptidsynthese

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Synthesen der Liganden 16 und 17 erfolgreich verliefen und es durch die Substitution des L-Prolinols durch L-Alaninol nicht mehr zu der Ausbildung eines cis-/trans-Isomerengemisches kommt. Die Gesamtausbeuten der Synthese der Liganden 16 und 17 waren jedoch mit 13% bzw. 16% nicht zufriedenstellend, so dass vor der Synthese der Liganden 18-23 eine Analyse und Optimierung der einzelnen Syntheseschritte zur Darstellung der Liganden erfolgte.

Die Ausbeuteberechnungen der Auswaagen der ersten Kupplung und die durch die Fmoc-Methode erhaltenen Werte befanden sich in der gleichen Größenordnung (41% durch die Fmoc-Bestimmung bzw. 24-40% durch die Auswaage). Es wurde zusätzlich festgestellt, dass die Ausbeuten der Reaktion bis zu einer Reaktionszeit von drei Stunden ansteigen, jedoch bei einer Verlängerung der Reaktionszeit wieder abfallen. Es scheinen hierbei nicht geklärte Nebenreaktionen vorzukommen, die das Produkt im Verlauf einer verlängerten Reaktionszeit zersetzten und somit die Ausbeute verringern. Die in diesen Versuchen ermittelte maximale Ausbeute von 40% ist jedoch im Rahmen der Standardpeptidverknüpfung sehr gering. Aus diesem Grund wurde der Einfluss eines alternativen Aktivators auf die Kupplungsausbeute untersucht.

Als alternativer Aktivator wurde das Azabenzotriazol-Derivat HATU verwendet. Die Aza-Derivate¹⁶⁷ haben sich im Gegensatz zu ihren entsprechenden Benzotriazol-Derviaten¹⁶⁸ als effizienter herausgestellt. Als Ergebnis der HATU-Versuchsreihe ist festzuhalten, dass die Ausbeuten der Kupplung durch die Verwendung von HATU als Aktivator im Verhältnis zur TBTU-Versuchsreihe gestiegen sind. Ebenfalls ist ein gleicher Zusammenhang zwischen Reaktionszeit und Reaktionsausbeute zu erkennen wie bei der TBTU-Reihe. Jedoch ist die maximale Ausbeute mit 77% nach drei Stunden Reaktionszeit zu gering.

Im Anschluss durchgeführte Analysen der RP-HPLC-Läufe der einzelnen Reaktionen ergab neben dem Produktpeak (Rt = 29 Minuten) ein Nebenprodukt, welches nach 15 Minuten von der C18-Säule eluierte. Eine MALDI-TOF-MS-Analyse dieser Fraktion ergab, dass es sich um den TFA-Ester 65 des entsprechenden Produktes mit der Masse von 551 g/mol handelt (Abbildung 41).

NH O OtBu

O FmocHN

O CF₃

C₂₈H₃₃F₃N₂O₆ MG = 550.58 g/mol

65

Abbildung 41: Der TFA-Ester 65 des Kupplungsproduktes. Unter den gewählten Bedingungen der Abspaltung des Produktes vom Harz entsteht dieser Ester, der in die Betrachtungen der Ausbeuten der vorangegangenen Kupplungsreaktion mit einbezogen werden kann. Dieser TFA-Ester 65 könnte mittels 5%iger Natriumcarbonat-Lösung hydrolysiert werden, um den freien Alkohol für weitere Synthesen zugänglich zu machen.

Dieser Ester kann bei der Ausbeute der Kupplungsreaktion mit in Betracht gezogen werden, da die Veresterung letztlich nur durch die Abspaltbedingungen generiert wird und auch als Kupplungsprodukt gewertet werden kann. Um nachträglich die TFA-Ester 65 aller

Reaktionsansätze der HATU-Reihe, sowie die der TBTU-Reihe quantitativ in die Kupplungsausbeuten einfließen zu lassen, um die reale Gesamtausbeute zu bestimmen, wurden die Flächen der TFA-Ester-Peaks eines jeden Reaktionsansatzes integriert. Diese Integrale wurden in das Verhältnis zum Integral des TFA-Ester-Peaks bei dem HATU-Referenzexperiment gesetzt, um somit Rückschlüsse auf die jeweiligen Stoffmengen der TFA-Ester eines jeden TBTU- bzw. HATU-Experiments zu schließen. Das Ergebnis der realen Kupplungsausbeuten ist in der Tabelle 4 zusammengefasst.

Tabelle 4: Bestimmte Gesamtausbeuten der TBTU- bzw. HATU-Experimente mit In Bezugnahme des bei der Abspaltung entstehenden TFA-Esters 65. Der bei den vorangegangenen Experimenten beobachtete Trend, dass die maximale Gesamtausbeute bei einer Reaktionszeit von drei Stunden erzielt wurde, ist ebenfalls zu beobachten. Die prozentuale Ausbeute entspricht den allgemeinen Kupplungsausbeuten für Peptidsynthesen. Die um bis zu 30% niedrigere Gesamtausbeute der TBTU-Experimente ist durch die geringere Reaktivität des Aktivators bei der sterisch anspruchsvolleren Kupplung zu erklären.

Aktivator TBTU

Reaktionszeit [h] 64 [µmol] 65 [µmol] Gesamtausbeute [%]

1 2.42 4.55 69.7

2 3.31 4.72 80.3

3 3.96 4.91 88.7

6 3.52 4.55 80.7

12 3.08 4.55 76.3

24 2.42 3.64 60.6

Aktivator HATU

Reaktionszeit [h] 64 [µmol] 65 [µmol] Gesamtausbeute [%]

1 3.45 6.36 98.1

2 6.17 3.65 98.2

3 7.71 2.23 99.4

6 6.39 3.25 96.4

12 4.41 4.91 93.2

24 4.19 5.19 93.8

Die in der Tabelle 4 gezeigten Gesamtausbeuten der Kupplungsreaktionen verifizieren den vorher beobachteten Trend, dass die Ausbeuten der TBTU-Versuchsreihe wesentlich niedriger sind, als bei der Versuchsreihe mit dem potenteren Aktivator HATU. Ebenfalls sind die maximalen Ausbeuten bei beiden Versuchsreihen bei einer Reaktionszeit von drei Stunden

erzielt worden, wohingegen sich längere Kupplungszeiten negativ auf Gesamtausbeuten auswirkten. Erkennbar ist auch, dass die Ausbeuten der TBTU-Reihe mit bis zu 28%

wesentlich stärker variieren, als die der HATU-Reihe, deren Varianz nur knapp 6% beträgt.

Die nahezu quantitativen Ausbeuten der HATU-Reihen sind sehr zufriedenstellend, jedoch ist eine Reaktionszeit von bis zu drei Stunden für eine Kupplungsreaktion und die Verwendung des kostenintensiven HATU-Aktivators von Nachteil, so dass eine alternative Möglichkeit der Kupplung in Betracht gezogen wurde.

Die Verwendung einer mikrowellenunterstützten Synthese zur Beschleunigung der Reaktion bot sich als eine Alternative zur konventionellen Festphasenpeptidsynthese an. Hierbei basiert die Beschleunigung der Reaktion auf einer effizienten Erwärmung der Reaktionspartner durch die Absorption von Mikrowellenstrahlung. Durch die Bestrahlung einer Probe mit Mikrowellen richten sich die in der Probe befindlichen Ionen oder Dipole nach dem angelegten elektrischen Feld aus. Ist das angelegte Feld oszillierender Natur, so versuchen sich die Dipole innerhalb der Probe dem alternierenden elektrischen Feld anzupassen. Durch diesen Vorgang kommt es zu einem Verlust an Energie in Form von Wärme durch molekulare Reibung oder dielektrischen Abfall. Ist ein Dipol in der Probe jedoch nicht in der Lage, sich dem angelegten alternierenden Feld anzupassen oder ist zu schnell, so kommt zu keiner Erwärmung der Probe. Der für diese Arbeit zur Verfügung stehende Mikrowellen-Reaktor arbeitet mit einer Frequenz von 2.45 GHz, die sich genau in der Mitte dieser beiden dargestellten Extreme befindet. Molekulare Dipole sind somit zwar in der Lage sich dem alternierenden Feld anzupassen, folgen aber dem Feld nicht präzise, sondern leicht versetzt.^169-171

Im Bereich der Festphasenpeptidsynthese werden Mikrowellenreaktoren bereits erfolgreich verwendet. Dabei können sie die Reaktionszeit der Synthese verringern und die Ausbeute erhöhen.^172-174

Im Rahmen der Optimierung der Kupplungsreaktion wurden zwei unterschiedliche Ansätze mit Mikrowellenunterstützung durchgeführt. Im ersten Ansatz wurde TBTU, im zweiten Ansatz HATU als Aktivator verwendet. Die Ansatzgröße wurde wie in den vorangegangenen Versuchsreihen mit 10 µmol an L-Alaninol gewählt (Überschüsse der Aminosäure, Aktivatoren und Base waren ebenfalls gleich). Die einzelnen Ansätze wurden direkt nach dem Zusammengeben der Lösung im Reaktor für zehn Minuten und einer Leistung von 50 Watt bestrahlt. Dabei wurde die Zieltemperatur der Reaktionslösung auf 60 °C eingestellt. Nach

vollendeter Reaktion wurde die Reaktionslösung abgesogen, das Produkt vom Harz abgespalten und mittels RP-HPLC aufgereinigt. Die Ergebnisse dieser beiden Versuche sind in Abbildung 42 im Verhältnis zu den Gesamtausbeuten der besten TBTU-/HATU-Experimente bei Raumtemperatur dargestellt.

Abbildung 42: Dargestellt sind die maximalen Kupplungsausbeuten einer jeden Versuchsreihe. Die in den Mikrowellenexperimenten (Leistung: 50 Watt; T = 60 °C) ermittelten Gesamtausbeuten sind nach zehn Minuten mit 99.8% bzw. 99.9% als quantitativer Umsatz zu bewerten (Balken 1 und 2). Mit 99.4% nach drei Stunden Reaktionszeit bei Raumtemperatur ist das Kupplungsexperiment mit dem HATU-Aktivator ebenfalls nahezu quantitativ (Balken 4). In dem entsprechenden Drei-Stunden-TBTU-Experiment hingegen konnte nur eine Gesamtausbeute von 88.7% ermittelt werden (rot; Balken 3), womit diese Ausbeute für eine sequenzielle Peptidsynthese viel zu gering ist.

Es zeigt sich deutlich, dass der Einsatz von Mikrowellenenergie die Geschwindigkeit der Reaktion beschleunigt. So ist in beiden Experimenten eine nahezu quantitative Umsetzung zum Kupplungsprodukt nach zehn Minuten erreicht. Ähnliche Ausbeuten werden bei dem Experiment mit HATU bei Raumtemperatur nach drei Stunden erreicht, wohingegen die Gesamtausbeute des äquivalenten TBTU-Experiments bei Raumtemperatur mit ~ 89% um 10% niedriger liegt.

Zusammenfassend lässt sich über die Optimierung der Reaktionen an der Festphase sagen, dass die zuvor mittels der Fmoc-Methode ermittelten Ausbeuten der Realität entsprachen. Der ermittelte Wert der ersten Kupplungsreaktion des L-Threonins an das L-Alaninol lag jedoch

um bis zu 35% niedriger als bei der real ermittelten Ausbeute, die nach der Reinigung mittels RP-HPLC ermittelt wurde. Die Verwendung des potenteren Aza-Derivates HATU als Aktivator in der Kupplungsreaktion führte zu einer Verbesserung der Reaktionsausbeute bei allen durchgeführten Kupplungsexperimenten um über 30% gegenüber den durchgeführten TBTU-Experimenten. Ebenfalls ließ sich feststellen, dass sich eine verlängerte Reaktionszeit über drei Stunden hinaus negativ auf die Gesamtausbeute der Kupplungsreaktion auswirkten und somit zu vermeiden ist. Die Reaktionszeit konnte einhergehend mit einer Verbesserung zu nahezu quantitativen Ausbeuten durch die Verwendung von Mikrowellenenergie auf zehn Minuten verkürzt werden. In den Mikrowellen-Experimenten stellte sich heraus, dass die Ausbeuten der Kupplungen nicht von der Wahl der Aktivatoren TBTU bzw. HATU abhängen und somit dem kostengünstigeren TBTU der Vorzug gegenüber dem HATU gegeben werden sollte.