4. Ergebnis II: Identifizierung und in vitro Charakterisierung der regulatorischen Region des
4.3. Spezifische Aktivität der DCX-regulatorischen Region in jungen Neuronen aus embryonalen Primärkulturen des Maus-Telenzephalons
Ausführlicher als in den immortalisierten Zellkulturen wurde die Aktivität der DCX-regulatorischen Region in primären neuronalen Vorläuferzellkulturen untersucht.
Insbesondere sollte herausgefunden werden, inwieweit die Aktivität der Region nach transienter Transfektion von phuDCX-3509-EGFP mit der Aktivität des endogenen DCX-Promotors übereinstimmte.
Abb. 4.7 Primäre telenzephale Vorläuferzellkulturen (MEF-Zellen) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Präparation, aus Mäusen zum Embryonaltag 10,5 bis 12,5 gewonnenen.
Als Kultursystem dienten die bereits unter 4.2. erwähnten, zum Embryonaltag 10,5 bis 12,5 aus Mäusen gewonnenen, dissoziierten telenzephalen Vorläuferzellkulturen (MEF-Zellen). Zunächst wurde eine detaillierte Zelltypanalyse an diesem primären Zellkulturmodell durchgeführt, um speziell das DCX-Expressionsmuster zu untersuchen. Die primären MEF-Kulturen eigneten sich
besonders deshalb für die vorliegende Fragestellung, weil sie die verschiedenen Zelltypen des sich entwickelnden Nervensystems enthielten.
Abb. 4.7 zeigt Kulturen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Präparation. Die Zellen wurden ohne den Zusatz von Wachstumsfaktoren in 5 % FKS enthaltendem Neurobasal-Medium und auf Poly-Ornithin-/Laminin-beschichteten Oberflächen kultiviert. Nach Anheften der zunächst kugeligen Zellen an die Kulturschale bildeten die Zellen allmählich Ausläufer und schließlich differenzierte Kulturen.
Abb. 4.8 A gibt einen Überblick, welche Zelltypen in der primären MEF-Kultur nach einer Woche unter Differenzierungsbedingungen anzutreffen waren. Zellen der Kulturen ließen sich mittels Antikörpern gegen verschiedene Marker anfärben: den Stammzellmarker Nestin, KI-67 als Marker für mitotische Zellen, die früh bis pan-neuronalen Marker DCX, Klasse III β-Tubulin und Map2, die schwere Untereinheit des Neurofilaments (NF-200) als adulten neuronalen Marker, sowie die glialen Marker GFAP (Astrozyten) und Galactocerebrosid (GalC) (Oligodendrozyten) (Abb. 4.8 A).
Ausgewertet wurde darüber hinaus, welchen Anteil der jeweilige Zelltyp nach 2 bzw. 7 Tagen an der primären Kultur hatte (Abb. 4.8 B, D). Nach sieben Tagen wurden zusätzlich Antikörper gegen verschiedene Neurotransmitter (Calbindin, Calretinin, CHAT, GABA, Serotonin, TH) eingesetzt, um eventuell neuronale Subtypen in den Kulturen aufzuspüren. Die Mehrheit der Zellen exprimierten spezifische Marker für neuronale Vorläuferzellen oder pan-neuronale Marker wie DCX, Klasse III β-Tubulin und Map2. Ein kleinerer Teil der Zellen exprimierte GFAP, wenige Zellen exprimierten Nestin, KI-67, Calbindin, Calretinin, GABA oder Serotonin. Für ChAT, TH und GalC fand sich praktisch keine Immunoreaktivität.
Zusätzlich wurde untersucht, welche dieser Marker gleichzeitig mit DCX in MEF-Zellen anzutreffen waren (Abb. 4.8 C, E). DCX-Expression ko-lokalisierte mit früh-neuronalen Markern wie Klasse III β-tubulin (in 87,5% der DCX-exprimierenden Zellen nach 2 Tagen in Kultur; in 75,0% nach einer Woche in Kultur) und Map2 (in 67,5% nach 2 Tagen; in 87,5% nach einer Woche), einige DCX-positive Zellen waren gleichzeitig positiv für NF200 (3,3 % nach 2 Tagen; 13,3% nach einer Woche). Nach 2 Tagen war ein geringer Teil der DCX-exprimierenden Zellen noch mitotisch aktiv, detektiert über die Ko-Lokalisation mit KI-67 (5%). Keinerlei Ko-Lokalisation von
Abb. 4.8 Zelltypanalyse in primären Maus-Vorläuferzellkulturen (MEF-Zellen). A) Primäre MEF-Zellen wurden nach sieben Tagen in Kultur immunzytochemisch untersucht, „merged“ = Überlagerung. DCX-Expression war mit βIII Tubulin und Map2 ko-lokalisiert, z. T. auch mit NF200 und Ki-67, jedoch nicht mit Nestin, GFAP oder GalC. Messbalken 100 μm B) – E) Quantitative Zelltypanalyse in MEF-Zellen nach 2 Tagen (B, C) und 7 Tagen (D, E). B) und D) prozentuale Anteile der Marker an der gesamten Kultur, C) und E) prozentuale Anteile der Ko-Expression in DCX-exprimierenden Zellen. DCX ist vornehmlich in jungen Neuronen vorhanden (Ko-Expression von βIII Tubulin und Map2).
DCX fand sich dagegen mit Nestin, Calbindin, Calretinin, GABA, Serotonin, ChAT, TH, GFAP oder GalC. DCX-Expression war demnach im MEF-Zellkultursystem spezifisch für proliferierende neuronale Vorläuferzellen und junge Neurone. Das beobachtete Muster der DCX-Expression in primären MEF-Kulturen stimmt überein mit der bekannten Expression von DCX in vivo, weshalb sich das MEF-Kulturmodell gut für die vorliegende Promotoranalyse eignete.
Abb. 4.9 Quantitative Analyse der Zell-Identität von MEF-Zellen mit aktiver DCX-regulatorischer Region. Primäre Maus-Vorläuferzellkulturen (MEF-Zellen) wurden transient mit phuDCX3509-EGFP transfiziert und drei Tage später auf EGFP-Expression und die Expression spezifischer Marker untersucht. Prozentuale Anteile EGFP-positiver Zellen, welche den jeweiligen Marker ko-exprimierten, sind gezeigt. Ebenfalls untersucht wurde DCX-EGFP-Ko-Expression nach Transfektion mit pEGFP-N1.
Als nächstes richtete sich der Blick auf diejenigen Zellen in der primären MEF-Kultur, welche das Reporterprotein EGFP nach transienter Transfektion mit phuDCX3509-EGFP exprimierten. Insbesondere sollten diese EGFP-positiven Zellen den in MEF-Zellen beschriebenen Zelltypen zugeordnet werden. Analysiert wurden die Eigenschaften phuDCX3509-EGFP exprimierender Zellen sowohl qualitativ (Abb.
4.10), als auch quantitativ (Abb. 4.9). In konfokaler Mikroskopie zeigte sich, dass die überwiegende Mehrheit der EGFP-exprimierenden Zellen endogenes DCX besaßen (87,5% der exprimierenden Zellen) (Abb. 4.9, 4.10). Zellen mit EGFP-Reporterprotein exprimierten darüber hinaus Klasse III β-Tubulin (32,5%), Map2 (70,8%) und NF200 (25,8%). Ko-Expression mit KI-67 fand sich in 22,5% der EGFP-positiven Zellen, dagegen exprimierte keine der EGFP-EGFP-positiven Zellen Nestin oder GalC. Ein kleiner Anteil der EGFP-exprimierenden Zellen war positiv für GFAP (3,3%). Letzteres könnte auf erleichterte Ko-Existenz neuronaler Marker mit GFAP unter Zellkulturbedingungen zurückzuführen sein. Die Gestalt EGFP-exprimierender Zellen – meist kleiner Zellkörper, umgeben von bipolar oder oligopolar angeordneten Neuriten – glich deutlich dem typischen Erscheinuungsbild neuronaler Vorläuferzellen und junger Neuronen (Abb. 4.10).
Abb. 4.10 Analyse der Zell-Identität in primären MEF-Zellen mit aktiver DCX-regulatorischer Region.
Primäre MEF-Zellen wurden transient mit phuDCX3509-EGFP transfiziert und drei Tage später auf Expression und die Expression spezifischer Marker untersucht. Linke Spalte zeigt EGFP-Expression, die zweite Spalte die Expression spezifischer Marker, die dritte zeigt Zellkerne nach To-pro-3-Anfärbung, ganz rechts ist die Überlagerung („merged“) der drei ersten Spalten zu sehen. EGFP-positive Zellen ko-exprimieren DCX, Map2 und βIII Tubulin, z.T. auch KI-67, sehr wenige GFAP, keine Ko-Expression wurde für Nestin gefunden. Messbalken 100 μm.
Um auszuschließen, dass die Mehrheit der EGFP-positiven Zellen nur deshalb DCX exprimierte, weil sich dieser Zelltyp möglicherweise leichter transfizieren ließ, wurden MEF-Kulturen mit pN1 transfiziert und nun auch hier in EGFP-positiven Zellen nach DCX-Expression gefahndet: 13,3% der EGFP-EGFP-positiven Zellen exprimierten nach einer Woche in Kultur auch DCX. Diese Zahl ist vergleichbar mit dem Anteil endogen DCX-exprimierender Zellen von 18,3%, wie er nach einer Woche in den MEF-Kulturen ausgezählt worden war (Abb. 4.8 D); DCX-exprimierende Zellen sind demnach nicht präferentiell transfizierbar.
Zusammengefasst zeigt sich, dass die 3509 bp große DCX-regulatorische Region ausreichend ist für die spezifische Expression des EGFP Reporterproteins in neuronalen Vorläuferzellen. Zusätzlich lassen die gewonnenen Daten den Schluss zu, dass die Aktivität der 3509 bp großen Region mit dem Expressionsmuster endogenen Doublecortins übereinstimmt.