4. Ergebnis II: Identifizierung und in vitro Charakterisierung der regulatorischen Region des
4.2. Spezifische Aktivität der regulatorischen Region des humanen Doublecortin-Gens in Zellkulturen neuronalen Ursprungs
Die hohe Homologie zwischen den drei Spezies sowie gefundene Transkriptionsfaktor-Bindestellen ließen den 3,5 kbp großen Abschnitt strangaufwärts des DCX-Gens bedeutsam für die Regulation des Gens erscheinen. Um diese Vermutung zu bestätigen, wurde die Aktivität der Region in verschiedenen neuronalen und nicht neuronalen Zell-Typen untersucht, verwendet wurde die entsprechende genomische Region des humanen DCX-Gens. Die 3509 bp umfassende regulatorische Region des humanen DCX-Gens kontrolliert im Vektor phuDCX3509-EGFP die Expression des fluoreszenten Reporterproteins EGFP. Die Stärke der EGFP-Expression in transient transfizierten Zellen wurde als Indikator für die Aktivität der
DCX-regulatorischen Region in der jeweiligen Kultur gewertet. Verglichen wurden etablierte, immortalisierte Zelllinien wie die nicht neuronalen HEK293 und COS7, gliale Zellen wie die astrozytäre Linie CTX TNA2 und die oligodendrogliale Linie N20.1, sowie neuronale Zelllinien (die Medulloblastom-Linie D283 Med und die Maus Neuroblastom Linie Neuro-2a). Darüber hinaus wurde die Aktivität der DCX-regulatorischen Region in primären, neuronalen Vorläuferzellkulturen untersucht;
hierzu waren Zellen des Telenzephalons von C57Bl/6Ncrl-Mäusen zum Embryonaltag 10,5 bis 12,5 (hier kurz MEF-Zellen genannt) in Kultur genommen worden.
Abb. 4.4 Western Blot Analyse verschiedener Zelllinien bezüglich der Expression von DCX. Protein-Extrakte (5µg pro Spur) aus verschiedenen Zelllinien wurden auf die Anwesenheit von DCX bzw. zur Kontrolle auf die von Aktin untersucht. HEK293, COS7 = nicht-neuronale Zelllinien; CTX TNA2 = Astrozyten-Linie; N20.1 = Oligodendrozyten-Linie; D283 Med = humane Medulloblastom-Linie;
Neuro-2a = Maus-Neuroblastom-Linie; MEF = primäre telenzephale Zellen der Maus (Embryonaltag 10.5 bis 12.5). Keine DCX-Expression fand sich in HEK293, COS7, CTX TNA2 und N20.1; D283 Med exprimierten niedrige Mengen DCX, Neuro-2a nicht detektierbare Mengen DCX. Beachtenswert ist die starke Expression von DCX in primären MEF-Kulturen. Transfektion mit phuDCX3509-EGFP oder pEGFP-N1 hatte keinen Einfluss auf die Menge endogenen Doublecortins in MEF-Zellen.
Mit Hilfe proteinbiochemischer Verfahren (Western Blot) wurde zunächst festgestellt, inwieweit die verschiedenen Kulturen endogen Doublecortin exprimierten.
Keine DCX-Expression zeigten die nicht neuronalen Zelllinien HEK293 und COS7 sowie die astrozytäre Linie CTX TNA2 und die oligodendrogliale Linie N20.1 (Abb.
4.4). Humane Medulloblastom-Zellen (D283 Med) exprimierten geringe Mengen des Proteins, in der murinen Neuroblastom-Zelllinie Neuro-2a lag die DCX-Expression unterhalb des Grenzwerts der Detektion (Abb. 4.4). Große Mengen des Proteins fanden sich dagegen in Extrakten aus embryonalen Kulturen (MEF-Zellen) (Abb. 4.4).
Abb. 4.5 Aktivität der humanen 3,5 kbp DCX-regulatorischen Region ist spezifisch für Zellen neuronalen Ursprungs. Verschiedene Zellkulturen wurden transient mit pEGFP-N1 oder phuDCX3509-EGFP transfiziert und bezüglich phuDCX3509-Expression zwei Tage nach der Transfektion untersucht. phuDCX3509- EGFP-Reportersignal ist ohne Antikörper-Verstärkung dargestellt, Zellkerne wurden mittels DAPI sichtbar gemacht. Alle Zelllinien ließen sich transfizieren, da alle nach Transfektion mit pEGFP-N1 das Reportergen unter Kontrolle des ubiquitären CMV-Promotors exprimierten. Unter phuDCX3509-EGFP war der Reporter fast aussschließlich in neuronalen Zelltypen wie D283MED, Neuro2A und primären MEF-Zellen exprimiert, schwache Expression fand sich in COS7-Zellen. Messbalken 100 μm.
In einem nächsten Schritt sollte die Expression von EGFP-Reporterprotein unter Kontrolle der DCX-regulatorischen Region verglichen werden mit EGFP-Expression unter Kontrolle des ubiquitären CMV-Promotors (Vektor pEGFP-N1). Ziel war es, die Aktivität der DCX-regulatorischen Region in den verschiedenen Zellkultursystemen zu bestimmen. Hierzu musste die unterschiedliche Transfizierbarkeit z.B. der immortalisierten Zelllinien gegenüber den primären Kulturen berücksichtigt, also ein interner Standard für jede Kultur gefunden werden. Dieser Standard war die Stärke der EGFP-Expression unter Kontrolle des ubiquitären CMV-Promotors, welche in parallel durchgeführten transienten Transfektionen beobachtet und quantifiziert wurde.
Kontroll-Transfektionen mit pEGFP-N1 zeigten, dass alle Zellkulturen transfizierbar waren und einzelne Zellen EGFP stark exprimierten (Abb. 4.5). Nach Transfektion mit phuDCX3509-EGFP war EGFP-Expression nicht oder kaum detektierbar in den nicht-neuronalen HEK293 und COS7, genauso wie in den glialen Linien CTX TNA2 und N20.1. Schwache EGFP-Expression fand sich in den neuronalen Zelllinien D283 Med und Neuro-2a, starke Expression in den primären Zellen (Abb. 4.5). Verglichen mit der neuronalen Linie Neuro-2a und den MEF-Zellen zeigten COS7 MEF-Zellen nach Transfektion mit phuDCX3509-EGFP schwache Expression des Reporterproteins (Abb. 4.5). Wurden die Ergebnisse aus dem Western-Blot (Abb. 4.4) den Ergebnissen zur EGFP-Expression unter Kontrolle der DCX-regulatorischen Region (Abb. 4.5) gegenübergestellt, so korrelierte das Vorhandensein endogenen Proteins stark mit der Reporter-Expression. Bemerkenswert war darüber hinaus, dass in primären MEF-Zellen die Menge endogenen Doublecortins konstant blieb, egal ob transfizierte oder untransfizierte Zellen betrachtet wurden (Abb. 4.4).
Um die Effizienz von Transfektion und Expression zu bestimmen, wurde ausgezählt, welcher Anteil der Zellen das EGFP-Reporterprotein unter Kontrolle der verwendeten Vektoren exprimierte. Obwohl alle Zellsysteme mit pEGFP-N1 transfizierbar waren, fanden sich doch deutliche Unterschiede. Unter Kontrolle des ubiquitären CMV-Promotors exprimierten 6% bis 14% der HEK293-, COS7- und Neuro-2a-Zellkulturen den Reporter EGFP, während CTX TNA2, D283 Med und primäre MEF-Zellen lediglich Transfektionsraten unter 3% erreichten (Abb. 4.6 A).
Im Vergleich dazu war der Anteil der unter Kontrolle der humanen DCX-regulatorischen Region EGFP-exprimierenden Zellen deutlich geringer, beobachtet
wurde allerdings hohe Spezifität der Expression für Zellen neuronalen Typs. Die relative Expressions-Effizienz des Vektors phuDCX3509-EGFP wurde errechnet, standardisiert über die Effizenz der Expression unter pEGFP-N1 (100 x Anteil der phuDCX3509-EGFP exprimierenden Zellen / Anteil der pEGFP-N1 exprimierenden Zellen). Hieraus errechnete sich, dass in bis zu 30,6% der phuDCX3509-EGFP transfizierten primären MEF-Zellen die 3509 bp große DCX-regulatorische Region aktiv war (Abb. 4.6 B). Geringere Expressions-Effizienz zeigten Neuro-2a und D283 Med (rund 7% bis 12%), inaktiv war die DCX-regulatorische Region in den nicht neuronalen Zelllinien A293, CTX TNA2 und N20.1. In COS7 Zellen war die DCX-regulatorische Region schwach aktiv (6,3%), was auf eine gewisse Durchlässigkeit der 3509 bp großen Region unter bestimmten zellulären Gegebenheiten schließen ließ.
Ähnliches war zuvor für den in neuronalen Zellen spezifisch aktiven Tau-Promotor gefunden worden: er zeigte in COS7 Zellen ebenfalls schwache Aktivität (Heicklen-Klein, 2000).
D283Med- und COS7-Zellen (0,1 > p > 0,05, N=3,*). C) zeigt die Analyse entsprechender Transfektionen im Western Blot unter Detektion von EGFP bzw. Aktin (5 µg Protein je Spur).
Abb. 4.6 Analyse von EGFP-Expression in verschiedenen Zelltypen. Zellen wurden transient mit pEGFP-N1 oder phuDCX3509-EGFP transfiziert, und zwei Tage später auf EGFP-Expression untersucht. A) zeigt die prozentualen Anteile EGFP-exprimierender Zellen unter pEGFP-N1 (weiße Balken) und phuDCX3509-EGFP (schwarze Balken) in drei unterschiedlichen Transfektionen. B) zeigt die relative Expressions-Effizienz von phuDCX3509-EGFP (zur Berechnung: s. Text). Beachtenswert ist die relativ hohe Expressions-Effizienz in primären MEF-Zellen trotz der geringen absoluten Zahl phuDCX3509-EGFP-exprimierender MEF-Zellen. Statistische Analyse mittels Students t-Test ergab hohe Signifikanz zwischen MEF- und COS7-Zellen (p <
0,005, N = 3, **) und geringe Signifikanz zwischen
In proteinbiochemischen Untersuchungen (Western Blot) zur Expression des EGFP-Reporters in transfizierten Zellen bestätigten sich diese Ergebnisse (Abb. 4.6 C): die verwendeten Zellkulturen exprimierten EGFP nach Transfektion mit pEGFP-N1 bereits in unterschiedlichem Ausmaß, waren demnach verschieden leicht transfizierbar; starke EGFP-Expression unter Kontrolle des ubiquitären CMV-Promotors fand sich für HEK293-, COS7- und Neuro2A-, schwächere für CTXKO29-, D283 Med- und MEF-Zellen; die Expression von EGFP unter Kontrolle der DCX-regulatorischen Region in COS7-, D283 Med- und Neuro2A-Zellen bestätigte sich, die Expression des Reporters in primären MEF-Zellen war im vorliegenden Western Blot aufgrund mangelnder Sensitivität des Assays nicht detektierbar (Abb. 4.6 C).
Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die 3509 bp große DCX-regulatorische Region spezifisch in Zellen neuronalen Ursprungs aktiv ist.